vault backup: 2025-11-24 13:07:23

content/Biokemi/Plasmidlabb/Rekombinant DNA-teknik Anteckningar.md

@@ -0,0 +1,126 @@
+---
+föreläsare: Oliver Forsell
+tags:
+  - biokemi
+  - anteckningar
+  - rekombinant-dna-teknik
+---
+Rekombinant DNA-teknik
+
+Steg
+- Molekylär kloning
+	- använder sig av en DNA snutt, en reflektionsenzym
+	- foga in det i en slags vektor, ofta i en plasmid
+	- Samma plasmid har förmåga klippa iihop samma baspar
+	- foga ihop sin DNA
+		- med hjälp av vegasenzym
+- Transformationen
+	- För in den här vektor i en värd-cell
+- Selektera och replikera
+	- Växa den i fermentortankar, så man får tillräckligt mycket av sitt material
+
+#### Plasmider
+
+Dubbelsträngat ciruklärt DNA, finns i de flesta bakterier.
+Självreplikera vid celldelning och gemensama gener
+t.ex. anti-biotikaresistens som bakterierna kan dela med sig
+kraftfullt verktyg som vi har lyckats att kapa
+
+Hur kan vi använda oss av det här?
+
+### Applications
+
+- Biomedicinska lösningar, t.ex. vaccin Hepatit-B 
+	- Framställer ett ytprotein på bakterien, istället för att injecra ett helt virus, det räcker med själva proteinet för att starta immunförsvaret istället för en riktig virus
+	- Produktion av insulin
+		- jästceller istället för bakterier
+		- post-transationella modifieringar
+		- de är eukaryota celler, så det krävs för insulin
+	- Koaguleringsfaktor-8
+
+GMO
+- Använder man av rekombinant DNA-teknik för att skapa, 
+- t.ex. resistens mot en herbicid
+Genterapi
+- CRISPR/Cas9 framställer man på det sättet
+- Kan ersätta delar av vårat DNA
+- behöver en vektor, för att transportera in
+	- Adeno-virus är en vanlig vektor, som man producera rekombinant
+Genanalys
+- polymeraser, Polymerace-Chain-Reaction. 
+	- en teknik för att detektera närvaron av ett viss protein
+	- de kan kopiera en molekyl många gånger
+	- specifika temperaturer med hjälp av rekombinant
+
+
+### Verktyg som behövs
+- "saxar", som kan bryta ner
+- "capping site" en plats i plasmiden där själva urklippandet kan ske
+	- en sekvens med baspar som enzymet känner igen
+- "limmet", dna-ligaser så det går att foga fast
+- värd-cell, ofta bakterieceller
+- rätt miljö, LP-medium ett slags näringsmedel som bakterier trivs i
+	- ska göra massa olika kopier, ofta proteiner av det
+
+### Vektorer
+Själva plasmiden, en slags molekyl som kan transportera DNA som vi är intresserad av
+
+En viktig del är 
+- Ori - origin of replication
+- massa olika baspar, som olika restriktionsmolekyler kan känna igen
+- AmpR: kan producera β-laktamas, den förhindra verkan av ampicilin
+- Promotor krävs för att pol ska kunna binda och uttrycka en gen
+- LacZ alpha: poängen 
+	- när vi inte fogat in våran gen är LacZ kontakt
+	- om vi för in den, bryter vi upp LacZ, för det vi klipper är i mitten av det
+	- om man inte fört in kommer LacZ kommer binda till alpha-peptiden i β-kalaktas
+	- Muterad E Coli-stammen så den har inte i sitt vanliga DNA den här alpha-peptiden, bara delta-delen,
+		- för att e coli ska kunna producera en b-kalaktas
+- IPTG inaktivar repressor genet
+	- om vi tillsätter IPTG så kommer det vara fritt fram att uttrycka alpha-
+
+### Restriktionenzymer
+- BamH I
+	- GGATC
+	- Generera strick enzo
+	- klipper snett för att det är lättare att sammanfoga sen
+
+### Värd-cell: E. Coli
+Vanligt modellorganism
+Gram negativ
+- den färgas rosa (positiva lila) med graminfärgning
+- de har tunt membranvägg
+- grovt dela upp bakterierar i de som har/inte har de yttre höljet
+Finns naturligt i tjocktermen
+
+
+### Insulin
+Började produceras 1920-talet
+Krävdes upp till 70 grisar för att hålla en person levande i ett år utan rekombinant DNA-teknik
+Utvann från bukspottskörteln, 1g på 70 grisar
+1970 utvecklades rekombinant DNA-teknik, kommerciellerades på 1980-talet
+
+### Labsyfte
+Ska avgöra om våran gen av intresse har lyckats klona in i vektorn
+Fokus är inte gen, mer på själva processen
+t.ex. insulin
+
+## Transformation
+
+Vi kommer använda oss av rekombinanta plasmider och kombinera de med e coli-celler
+Cellerna måste vara mottagliga för att ta upp plasmiden
+Calciumjoner neutraliserar den negativa ytan (fosfoliper och glykoliper), så att DNA kan närma sig ytan det är också negativt
+Sen höjer man med en värmsjuk, membranet blir permeabiliserat.
+
+blue-white screening
+lacz kommer naturligt med e coli, mutantsträng som saknar alphadelen.
+
+En analog till en galaktosias, den heter X-gal, när den bryts ner bildas galaktos, men den bildar också 4-chloro-3-bromo-indigo som gör att det blir blå, då kan vi se vilka bakteriera som har en intakt lacZ eller inte.
+
+De som har våran gen av intresse blir inte färgade, de är svåra att se, men inte osynliga.
+
+Western Blot kan man använda för att identifiera ett protein av intresse
+
+
+
+