From f4a149e4d5914c6909c422d68c2144a9b66ea5a9 Mon Sep 17 00:00:00 2001 From: Johan Dahlin Date: Mon, 24 Nov 2025 13:07:23 +0100 Subject: [PATCH] vault backup: 2025-11-24 13:07:23 --- .../Rekombinant DNA-teknik Anteckningar.md | 126 ++++++++++++++++++ 1 file changed, 126 insertions(+) create mode 100644 content/Biokemi/Plasmidlabb/Rekombinant DNA-teknik Anteckningar.md diff --git a/content/Biokemi/Plasmidlabb/Rekombinant DNA-teknik Anteckningar.md b/content/Biokemi/Plasmidlabb/Rekombinant DNA-teknik Anteckningar.md new file mode 100644 index 0000000..a4baa10 --- /dev/null +++ b/content/Biokemi/Plasmidlabb/Rekombinant DNA-teknik Anteckningar.md @@ -0,0 +1,126 @@ +--- +föreläsare: Oliver Forsell +tags: + - biokemi + - anteckningar + - rekombinant-dna-teknik +--- +Rekombinant DNA-teknik + +Steg +- Molekylär kloning + - använder sig av en DNA snutt, en reflektionsenzym + - foga in det i en slags vektor, ofta i en plasmid + - Samma plasmid har förmåga klippa iihop samma baspar + - foga ihop sin DNA + - med hjälp av vegasenzym +- Transformationen + - För in den här vektor i en värd-cell +- Selektera och replikera + - Växa den i fermentortankar, så man får tillräckligt mycket av sitt material + +#### Plasmider + +Dubbelsträngat ciruklärt DNA, finns i de flesta bakterier. +Självreplikera vid celldelning och gemensama gener +t.ex. anti-biotikaresistens som bakterierna kan dela med sig +kraftfullt verktyg som vi har lyckats att kapa + +Hur kan vi använda oss av det här? + +### Applications + +- Biomedicinska lösningar, t.ex. vaccin Hepatit-B + - Framställer ett ytprotein på bakterien, istället för att injecra ett helt virus, det räcker med själva proteinet för att starta immunförsvaret istället för en riktig virus + - Produktion av insulin + - jästceller istället för bakterier + - post-transationella modifieringar + - de är eukaryota celler, så det krävs för insulin + - Koaguleringsfaktor-8 + +GMO +- Använder man av rekombinant DNA-teknik för att skapa, +- t.ex. resistens mot en herbicid +Genterapi +- CRISPR/Cas9 framställer man på det sättet +- Kan ersätta delar av vårat DNA +- behöver en vektor, för att transportera in + - Adeno-virus är en vanlig vektor, som man producera rekombinant +Genanalys +- polymeraser, Polymerace-Chain-Reaction. + - en teknik för att detektera närvaron av ett viss protein + - de kan kopiera en molekyl många gånger + - specifika temperaturer med hjälp av rekombinant + + +### Verktyg som behövs +- "saxar", som kan bryta ner +- "capping site" en plats i plasmiden där själva urklippandet kan ske + - en sekvens med baspar som enzymet känner igen +- "limmet", dna-ligaser så det går att foga fast +- värd-cell, ofta bakterieceller +- rätt miljö, LP-medium ett slags näringsmedel som bakterier trivs i + - ska göra massa olika kopier, ofta proteiner av det + +### Vektorer +Själva plasmiden, en slags molekyl som kan transportera DNA som vi är intresserad av + +En viktig del är +- Ori - origin of replication +- massa olika baspar, som olika restriktionsmolekyler kan känna igen +- AmpR: kan producera β-laktamas, den förhindra verkan av ampicilin +- Promotor krävs för att pol ska kunna binda och uttrycka en gen +- LacZ alpha: poängen + - när vi inte fogat in våran gen är LacZ kontakt + - om vi för in den, bryter vi upp LacZ, för det vi klipper är i mitten av det + - om man inte fört in kommer LacZ kommer binda till alpha-peptiden i β-kalaktas + - Muterad E Coli-stammen så den har inte i sitt vanliga DNA den här alpha-peptiden, bara delta-delen, + - för att e coli ska kunna producera en b-kalaktas +- IPTG inaktivar repressor genet + - om vi tillsätter IPTG så kommer det vara fritt fram att uttrycka alpha- + +### Restriktionenzymer +- BamH I + - GGATC + - Generera strick enzo + - klipper snett för att det är lättare att sammanfoga sen + +### Värd-cell: E. Coli +Vanligt modellorganism +Gram negativ +- den färgas rosa (positiva lila) med graminfärgning +- de har tunt membranvägg +- grovt dela upp bakterierar i de som har/inte har de yttre höljet +Finns naturligt i tjocktermen + + +### Insulin +Började produceras 1920-talet +Krävdes upp till 70 grisar för att hålla en person levande i ett år utan rekombinant DNA-teknik +Utvann från bukspottskörteln, 1g på 70 grisar +1970 utvecklades rekombinant DNA-teknik, kommerciellerades på 1980-talet + +### Labsyfte +Ska avgöra om våran gen av intresse har lyckats klona in i vektorn +Fokus är inte gen, mer på själva processen +t.ex. insulin + +## Transformation + +Vi kommer använda oss av rekombinanta plasmider och kombinera de med e coli-celler +Cellerna måste vara mottagliga för att ta upp plasmiden +Calciumjoner neutraliserar den negativa ytan (fosfoliper och glykoliper), så att DNA kan närma sig ytan det är också negativt +Sen höjer man med en värmsjuk, membranet blir permeabiliserat. + +blue-white screening +lacz kommer naturligt med e coli, mutantsträng som saknar alphadelen. + +En analog till en galaktosias, den heter X-gal, när den bryts ner bildas galaktos, men den bildar också 4-chloro-3-bromo-indigo som gör att det blir blå, då kan vi se vilka bakteriera som har en intakt lacZ eller inte. + +De som har våran gen av intresse blir inte färgade, de är svåra att se, men inte osynliga. + +Western Blot kan man använda för att identifiera ett protein av intresse + + + +