medical-notes/content/Biokemi/🦠 Cellulära processer/Utforska proteiner/Slides.md

Att utforska proteiner

Sahlgrenska Akademin – LPG001 Biokemi – 2025-11-17
Linda Johansson, Ph.D. – linda.johansson.4@gu.se

---

Innehåll

• Begreppet ”proteom”
• Skillnader i proteiners kemiska och fysikaliska egenskaper och hur dessa ligger till grund för olika reningsprinciper:
  • gelfiltrering
  • jonbyteskromatografi
  • affinitetskromatografi
• Principer och tillämpning av elektrofores (SDS-PAGE)
• Översiktlig beskrivning av proteinanalys med immunologiska tekniker och ”blottning”
  • antikroppar och antigen
  • skillnad mellan monoklonala och polyklonala antikroppar
  • principen för ELISA
  • kliniska exempel
• Masspektrometri – introduktion
• Förutsättningar för proteinstrukturbestämning med:
  • röntgenkristallografi
  • NMR
  • kryo-EM
    och deras medicinska applikationer

---

Varför studera proteiner?

• Forskning:
  • strukturbiologi – hur proteiner ser ut
  • biokemi – vad de binder
  • var de finns i kroppen
  • hur de påverkar sjukdomar
• Klinik:
  • HIV-test (antikroppar, ELISA)
  • COVID-19 (antigen, antikropp, ELISA)
  • Myelom (detektion av IgM med proteinelektrofores)

---

Proteiner

• Proteiner utför viktiga funktioner i de flesta biologiska processer, t.ex. DNA-replikation och signalöverföring.
• Sensoriska funktioner som smak, lukt, temperatur och beröring bygger på proteiner.
• Aminosyrasekvensen bestämmer konformationen (3D-strukturen) och därmed funktionen.

---

Proteiner – 2024 års Nobelpris

• Handlar om proteiners strukturer och hur de kan designas och förutsägas.
• David Baker: byggt helt nya proteiner.
• Demis Hassabis & John Jumper: AI-modellen AlphaFold som löser strukturföre­spådningsproblemet.

---

Genom vs proteom

• Genom: komplett DNA-sekvens (~3 miljarder baser, ca 23 000 gener).
• Proteom: de proteiner som uttrycks av en cell vid en given tidpunkt.
• Proteomet påverkas av:
  • celltyp
  • tidpunkt
  • proteininteraktioner
  • posttranslationella modifieringar
• Proteomet är mycket dynamiskt och komplext.

---

Hur kan vi studera proteiner?

• Vi behöver rena fram ett specifikt protein ur cellens innehåll.
• Proteiner skiljer sig i:
  • storlek
  • laddning
  • löslighet
  • bindningsaffinitet
• Egenskaperna används i reningsmetoder.

---

Preparation av protein – homogenisat

• Celler bryts upp → homogenisat.
• Centrifugering separerar komponenter:
  • pellet: i botten
  • supernatant: ovanför

---

Kromatografi – princip

• Små kulor/beads med definierade egenskaper packas i en kolonn (fast fas).
• Buffert + prov rör sig genom kolonnen (mobil fas).
• Olika typer används beroende på proteinets egenskaper.

---

Gelfiltrering – separation efter storlek

• Porösa kulor släpper in små molekyler men inte stora.
• Stora proteiner kommer ut först.

---

Jonbyteskromatografi – separation efter laddning

• Proteinets totala laddning styr bindning.
• Anjonbytare: binder negativa grupper.
• Katjonbytare: binder positiva grupper.
• Eluering sker med pH-ändring eller saltgradient.

---

Affinitetskromatografi – separation efter selektivitet

• Specifik bindning mellan protein och ligand.
• Exempel: 6×His-tag → stark bindning till Ni²⁺-kolonn.
• Eluering ofta med imidazol.

---

Analys av proteinrening

• Flera reningssteg kombineras.
• Man följer renheten vid varje steg.
• Val av metod beror på:
  • önskad renhet
  • proteinets egenskaper

---

Gelelektrofores – princip

• Molekyler med nettoladdning vandrar i elektriskt fält.
• Polyakrylamidgel separerar efter storlek.
• Små proteiner rör sig snabbare.

---

SDS-PAGE

• SDS ger uniform negativ laddning proportionell mot massa.
• Separation sker enbart på storlek.
• Efter körning färgas gelen (Coomassie blue).

---

SDS-PAGE i reningskontroll

• Prover tas efter varje reningssteg.
• Rätt band ska bli tydligare och renare för varje steg.

---

Gelfiltrering vs SDS-PAGE

• Gelfiltrering: störst först, används för rening.
• SDS-PAGE: minst först, används för analys.

---

Antikroppar och antigen

• Antikroppar → proteiner som känner igen antigen.
• Del av antigenet som känns igen = epitop.

---

Monoklonala vs polyklonala antikroppar

• Monoklonala: känner igen exakt samma epitop.
• Polyklonala: mix som känner igen flera epitoper på samma antigen.

---

ELISA – princip

• Enzymbundet antikroppssystem som ger färg vid substrattillsats.
• Två huvudtyper:
  • Indirekt ELISA: detekterar antikroppar (t.ex. HIV)
  • Sandwich ELISA: detekterar antigen (t.ex. COVID-19)

---

Western Blot

• SDS-PAGE → proteiner förs över till membran.
• Inkuberas med primär + sekundär antikropp.
• Signal mäts via enzym eller fluorescens.

---

Masspektrometri – princip

• Identifierar peptider/proteiner.
• Möjliggör analys av posttranslationella modifieringar.
• Peptider joniseras → accelereras → separeras efter massa (t.ex. MALDI-TOF).

---

Masspektrometri – användning

• Identifiera proteiner
• Verifiera rening
• Kartlägga PTM
• Analysera sekvens och evolutionärt ursprung

---

Proteiners 3D-struktur

• Bestäms av aminosyrasekvens.
• Experimentella metoder krävs ofta trots AI-prediktioner som AlphaFold.
• Struktur är centralt för läkemedelsutveckling.

---

NMR

• Baserad på magnetiska atomkärnor.
• Resonans påverkas av atomernas omgivning.
• Typer:
  • 1D NMR – veckningsinformation
  • NOESY – avstånd mellan protoner (<5 Å)
• Begränsning: protein <50 kDa
• Resultat: ensemble av möjliga strukturer.

---

Röntgenkristallografi

• Proteinet kristalliseras.
• Kristall bestrålas med röntgen → diffraktionsmönster samlas.
• Matematiskt → elektrondensitetskarta → modell av struktur.
• Hög upplösning ger mer detaljer.

---

Kryo-EM

• Direkt visualisering av frys-införda molekyler.
• Kräver inga kristaller eller isotoper.
• Single-particle-analys möjlig.
• Snabb metodutveckling → dominerande teknik idag.
• Upplösning beror på proteinets storlek.
• Nobelpris 2017.

---

Kryo-EM – procedur

• Protein fryses på grid i flytande helium.
• Exponeras för elektronstråle i vakuum.
• Många 2D-bilder sammanställs → 3D-struktur.