420 lines
13 KiB
Markdown
420 lines
13 KiB
Markdown
- En jämförelse mellan eukaryota och prokaryota genom
|
|
- mycket är lika!
|
|
- Grundläggande enzymatiska processer vid eukaryot DNA replikation (mycket lik prokaryot!)
|
|
- dyker upp i läkemedel
|
|
|
|
Föreläsningen täcker bl.a.:
|
|
- Leading och Lagging strand
|
|
- Processivity och proofreading
|
|
- Replikationsgaffel och replisome
|
|
- Superhelicitet och topoisomeraser
|
|
- Nukleaser och ligaser
|
|
|
|
----
|
|
![[Pasted image 20251121091934.png]]
|
|
Bakterier har eget genom
|
|
- **Cirkulärt**
|
|
- vissa problem med linjär replikation av ändar
|
|
- fördelar, bara gå runt
|
|
- 500kbp till 11Mbp
|
|
- **Plasmider**
|
|
- samma typ av DNA, mindre och kan överföras mellan baktirer t.ex. antibiotikaresistens
|
|
- Har ett genom
|
|
|
|
FRÅGA: varför har människor inte plasmider för att överföra fördelar?
|
|
|
|
|
|
---
|
|
Eukaryota
|
|
![[Pasted image 20251121092321.png]]
|
|
- 30-100 ggr så större än bakteriella
|
|
- 3 Gbp
|
|
- Egna problem att det är så stort och linjärt
|
|
----
|
|
|
|
Bra att lära sig:
|
|
- DNA replikeras
|
|
- RNA transkription
|
|
- Protein translation
|
|
|
|
![[Pasted image 20251121092516.png]]
|
|
|
|
----
|
|
Redan Watts insåg att det var semi-konservativt så fort de förstod hur det såg ut.
|
|
Då blev allt väldigt uppenbart
|
|
|
|
Genom att titta så förstod man funktion, var komplimentära, samma information fanns i båda molekylerna
|
|
![[Pasted image 20251121092705.png]]
|
|
|
|
Viktigt:
|
|
- semi-konservativ som begrepp
|
|
- föräldrasträngen är den blå (parental)
|
|
- nybildadsträng är den röda (nascent)
|
|
|
|
---
|
|
|
|
![[Pasted image 20251121092822.png]]
|
|
|
|
Krångligt att rita ut helixarna, blir linjärt för förenkling
|
|
|
|
Man börjar på många olika ställen
|
|
- bildar replikationsbubblor
|
|
- sen växer bubblorna åt båda hållen
|
|
- så småningom når det varandra, då går de ihop och då får vi nya strängar
|
|
|
|
Bubblorna startar vid "origin of replication" och är **många**, som är väl definierade, väl reglerade
|
|
Många sjukdomar beror på för mycket/lite dna, eller skapat dna,
|
|
jättereglerat, en gång, det måste ske samtidigt över hela molekylen.
|
|
|
|
Varje bubbla har två replikationsgafflar
|
|
|
|
----
|
|
![[Pasted image 20251121093320.png]]
|
|
Bakteriell DNA behöver inte så många replikationsgafflar
|
|
Har bara **ett** origin of replikation
|
|
|
|
----
|
|
|
|
Hur går det till att läsa av båda två strängarna i samma riktining?
|
|
|
|
----
|
|
![[Pasted image 20251121093608.png]]
|
|
|
|
- föräldrasträngarna är antiparallela (övre)
|
|
- undre är inga problem, mall och så bygger man en i taget
|
|
- Mallsträngen går från 3' till 5' felaktig
|
|
- behöver en nödläsning
|
|
- gör korta snuttar
|
|
- lägga en ny som går bakåt
|
|
|
|
Så
|
|
- en kontinuerligt
|
|
- en med små korta snuttar
|
|
|
|
|
|
---
|
|
![[Pasted image 20251121093757.png]]
|
|
Man brukar prata om två olika
|
|
- kontinuerligt: leading strand
|
|
- små fragment: lagging strand
|
|
- varje fragment heter okazaki fragment
|
|
- döpt efter en japansk gästforskare på stanford
|
|
- 100-200 nukleotider i eukaryoter
|
|
- 1000-2000 i prokaryoter
|
|
|
|
FRÅGA: varför storleks skillnad mellan eukaryoter och prokaryoter?
|
|
|
|
---
|
|
![[Pasted image 20251121094040.png]]
|
|
Måste ske av ett helt enzymmaskineri
|
|
För att lyckas så måste vi ha ett antal enzymer
|
|
te.x ett som hjälper till att dela
|
|
skillnad mot RNA:
|
|
- bubblan öppnar bara upp en liten bit
|
|
- kräver mycket mer kraft krävs (helikas)
|
|
- polymeras för att sätta på
|
|
- krävs en för både lagging och leading
|
|
|
|
---
|
|
![[Pasted image 20251121094218.png]]
|
|
Viktigaste enzymet!
|
|
DNA-polymeras
|
|
- hjälpa till och skapa en struktur
|
|
- nya nukleotider som kan baspara
|
|
- kallas DNA-syntes
|
|
- DNA-polymeraset hjälper till att välja ut rätt nukleotid
|
|
- kan hamna snett, när det inte sitter perfekt så bildas det inget nytt fosfodiesterbindning
|
|
- när rätt nukleotid är på plats, nu verkar allt stämma då sker det en liten ändring i strukturen - click säger det och kopplar på i den nya kedjan
|
|
- får energi av fosfatgrupperna som trillar av ATP
|
|
- då öppnar sig DNA-polymeraset och rör sig en liten bit
|
|
|
|
FRÅGA: krävs det ett ATP per replikerad nukleotid?
|
|
|
|
----
|
|
Magnesiumjoner hjälper DNA-polymeraset att sätta fast nya nukleotider
|
|
SLIDE SAKNAS
|
|
|
|
interaktion med magnesiumjoner, hjälper till att lägga så allt ligger väldigt nära varandra
|
|
det hjälper till att få en reaktion
|
|
skapa en ny fosfodiesterbindnig
|
|
|
|
---
|
|
![[Pasted image 20251121094606.png]]
|
|
påminner om en högerhand som växer
|
|
|
|
---
|
|
![[Pasted image 20251121094625.png]]
|
|
kärnpunkten i vad DNA-polymeras behöver göra
|
|
|
|
När det inte funkar kan man få väldigt tråkiga sjukdomar, t.ex. sjukdom vid 13 och går bort vid 20. I mitokondrier, talar mer om det i T3
|
|
|
|
Cancer orsakas pga av mutation, då man inte kan mutera DNA på rätt sätt.
|
|
|
|
DNA-polymeraset måste vara
|
|
- noggrant - kallas även **fidelitet**
|
|
- annars mutationer och kanske sjukdomar
|
|
- effektivt - kallas **processivitet**
|
|
- måste fungera på väldigt långa sträcker, vara väldigt noggrant och en hög processivitet, långa sträcker utan att falla av
|
|
|
|
----
|
|
![[Pasted image 20251121094943.png]]
|
|
|
|
Ibland blir det fel, kommer in en felaktig nukleotid
|
|
|
|
Det finns en möjlighet för DNA-polymeraset att fixa det, det har inte bara
|
|
- att röra sig framåt
|
|
- men har också möjligheten att backa
|
|
- exonukleoasaktivtet (ta bort ifrån änden)
|
|
|
|
Förmågan att backa kallas proofreading
|
|
|
|
----
|
|
|
|
SLIDE endonukleaser/exonukleaser saknas
|
|
|
|
----
|
|
|
|
endonukleas
|
|
- ta bort i mitten
|
|
exonukleas kan delas upp i två grupper
|
|
- ta bort i en ände
|
|
- 5'
|
|
- 3'
|
|
---
|
|
|
|
![[Pasted image 20251121095304.png]]
|
|
|
|
Måste vara processiva (effektiva!)
|
|
Miljoner, miljarder baspar som måste replikeras
|
|
Måste köra under en lång tid
|
|
|
|
Processivitet = förmågan att koppla på **många** nukleotider till den **växande** DNA-strängen, utan att polymeraset **lossnar** från mallsträngen.
|
|
|
|
sliding camp - klämma
|
|
- sätter sig fast i änden
|
|
- fungerar som ett ankar som håller kvar DNA
|
|
- ökar effektivtet 50ggr för att DNA-polymeraset inte lossnar
|
|
- utan: 10-20 nt/s
|
|
- med: 500-1000nt/s
|
|
|
|
----
|
|
**Problem vid DNA-replikation (2)**
|
|
DNA-polymeraser kan inte starta DNA replikation _de novo_. De behöver en primer.
|
|
|
|
de novo = från ingenting
|
|
|
|
----
|
|
![[Pasted image 20251121095710.png]]
|
|
För att börja, behöver vi en liten startpunkt som är en RNA primer.
|
|
|
|
RNA-polymeras kan startas **de novo**
|
|
DNA-polymeras behöver en RNA-primer
|
|
|
|
Finns ett specialiserat DNA-polymeras som bara gör väldigt korta strängar, behöver bara en liten snutt, som det vanliga DNA-polymeraset kan starta och köra igång
|
|
- det kallas för DNA-primas
|
|
|
|
I våra celler sitter DNA-polymeras tillsammans med DNA-primas (kommer senare)
|
|
|
|
----
|
|
![[Pasted image 20251121095938.png]]
|
|
|
|
leading strand: primers behövs bara en primer
|
|
lagging strand: en primer per fragment
|
|
FRÅGA: hur lång är en fragment
|
|
FRÅGA: varför kan man inte bygga bakvänt?
|
|
- har med fosfatbryggan, naturen har valt att göra det
|
|
FRÅGA: plockas primern bort?
|
|
- vi vill inte ha RNA i DNA
|
|
- vi vill inte ha en lucka
|
|
|
|
---
|
|
|
|
Problem vid DNA-replikation (3)
|
|
På lagging-strängen finns en RNA-primer i början av varje Okazaki-fragment!
|
|
Vi vill inte ha sträckor av RNA i DNA-molekylen!
|
|
|
|
---
|
|
|
|
Energin kommer med den inkommande nukleotiden
|
|
det bestämmer att reparation måste gå i rätt riktning
|
|
trifosfater är lite instabila, de kan gå sönder, sitter de på DNA-kedjan kan det bli katastrof.
|
|
|
|
okazaki-fragement kan variera i längd, när de nått en viss längd så lossnar maskineriet
|
|
|
|
----
|
|
![[Pasted image 20251121102046.png]]
|
|
|
|
VIll ta bort - fragement maturation
|
|
- steg 1 RNA-primer
|
|
- steg 2 brytpunkten, DNA-fragmenten måste sitta ihop ordentligt
|
|
- försluter ryggraden så den blir hel
|
|
- kallas ligering - klistrar ihop fragmenten
|
|
- får inte finnas brott (nicks)
|
|
|
|
----
|
|
|
|
![[Pasted image 20251121102319.png]]
|
|
|
|
#### Steg 1
|
|
|
|
Från vänster närmare sig det nya fragmentet
|
|
DNA polymerases stannar inte, det krashar in i RNAt, när det händer så släpper det från DNA, de sitter inte längre hybridiserat. Bildar en lite flärp, flap. Som petar ut det här RNA, medan DNA finns kvar på strängen
|
|
|
|
Finns ett speciellt endonukleas som känner igen detta flappar, kallas Flap Endonukleass 1 eller FEN1 som kan komma in och klyva.
|
|
Sen finns det bara en litet nick kvar, allt RNA är borta.
|
|
Det är eukaryota celler när vi ta bort
|
|
|
|
---
|
|
### Steg 2
|
|
|
|
![[Pasted image 20251121102545.png]]
|
|
Använder energi från ATP för att laga nicken, det är DNA-ligas som lagar.
|
|
Själva nicken är avsaknaden av en fosfodiesterbrygga, alla nukleotider finns men en brygga saknas.
|
|
|
|
----
|
|
![[Pasted image 20251121102658.png]]
|
|
Använder ATP som en ko-faktor som kan klistras ihop.
|
|
|
|
---
|
|
**Problem vid DNA-replikation (4)**
|
|
|
|
DNA är dubbelsträngat! Hur kan vi dela på strängarna så att DNA replikation kan ske?
|
|
|
|
---
|
|
|
|
|
|
![[Pasted image 20251121102747.png]]
|
|
|
|
|
|
|
|
Helikas är en grupp av enzym:
|
|
- en förmåga att dela DNA
|
|
- finns olika beroende på process
|
|
|
|
I DNA-replikationen sitter helikaset längst fram, det är det som gör att gaffeln kan röra sig.
|
|
- det binder till en av strängarna, fungerar som en kil
|
|
- klättrar på en sträng, så pressar det isär DNA som finns framför
|
|
-
|
|
|
|
----
|
|
![[Pasted image 20251121102941.png]]
|
|
- Består av 6 st identiska subenheter
|
|
- Den bildar runt DNA
|
|
- Har förmåga att klättra som en repklättrare
|
|
- Hydroliserar ATP använder energi från det
|
|
- den rör sig upp för det här och så växer gaffel, så går den längre och längre uppför
|
|
- klättrar utmed
|
|
- snurrar runt lite här
|
|
- alla olika subenheter kan hydrolisera ATP, det blir som en rörelse uppåt
|
|
|
|
På leadning strand sitter DNA-pol en liten bit efter
|
|
För lagging strand är det lite mer komplicerat, måste finns upp till 200 nt lång sträcka innan man syntesiserar, måste skydda DNA i den biten, känsligt för omgivningen, mycket som reagera, som går in och basparar med sig själv
|
|
Måste stabilisera det enkelsträngade DNA så inte det sker
|
|
|
|
Kallar de för enkelsträngadeproteiner
|
|
|
|
---
|
|
|
|
![[Pasted image 20251121103232.png]]
|
|
|
|
Allt det här stimulerar DNA-replikation, för att det ska kunna ske effekivt
|
|
I de flesta celler kallar det single-cell-binding protein
|
|
|
|
Replication Protein A kallas det i våra celler RPA, spelar en viktig roll här.
|
|
|
|
---
|
|
![[Pasted image 20251121103336.png]]
|
|
Proteinerna fungerar tillsammans som ett maskineri, de viktig att alla är på plats tillsammans
|
|
Ofta bildar de interaktioner mellan varandra
|
|
Helikaset känner av att det finns ett single-stranding DNA binding, de stimulerar **varandra** så de vågar röra sig framåt, de blir mer effektivt.
|
|
Om man återskapar det här i ett provrör, om man lägger till ett single-stranding DNA.
|
|
|
|
----
|
|
|
|
www.youtube.com/watch?=l9ArIJWYZ
|
|
|
|
---
|
|
|
|
**Problem vid DNA-replikation (5)**
|
|
|
|
När man tvingar isär dubbelhelixen så skapas topologiska problem.
|
|
|
|
Varför och hur löser cellen detta?
|
|
|
|
----
|
|
När vi gör en DNA-replikation kan snörerna svängarna/helixarna, har ingenstans att ta vägen, de kommer bli massa spänningar i det här DNA. Tänk skosnöre som är tvinnat.
|
|
Man kan inte förvänta sig att det ska lösa sig självt.
|
|
|
|
![[Pasted image 20251121103747.png]]
|
|
|
|
Det blir massa spänningar och jobbigt, massa konstiga sekundärstrukturer.
|
|
Som heter **supercoils**
|
|
|
|
Det blir mkt motstånd, måste bli av med spänningarna, behöver någonting framför för att slappna av DNA:t
|
|
|
|
----
|
|
|
|
![[Pasted image 20251121103912.png]]
|
|
|
|
Går inte att snurra DNA-molekylerna, de blir fixerade och tar man bara helikaset.
|
|
Ju mer man kör ju mer spänningar, konstiga strukturer, stannar replikationen.
|
|
Får detta att slappna av.
|
|
|
|
---
|
|
Linking DNA
|
|
|
|
|
|
- Har ungefär 10.4 bp/varv. Fin avslappnad och optimerad DNA-helix.
|
|
- 160bp lång, får plats med 25 varv
|
|
![[Pasted image 20251121104100.png]]
|
|
|
|
Man kan slå ihop de, så blir de så fint här:
|
|
![[Pasted image 20251121104106.png]]
|
|
|
|
Men vad händer om man introducerar 5 extra varv, då bygger vi upp spänningar i molekylen.
|
|
Linking Number (Lk) är antal varv, det ska motsvara det optimera och helst vara 25 varv för 160 bp
|
|
- vad händer om det är mer eller mindre
|
|
- då förstör man DNA, det skapar topologisk stress
|
|
|
|
Stress = fler antal varv än DNA strängarna
|
|
|
|
----
|
|
Topoismeraser är de som tar bort spänningarna i DNA.
|
|
|
|
Det är specilla enzymer.
|
|
topo=läge
|
|
iso=samma
|
|
meris=del
|
|
-as=enzym
|
|
|
|
Typ I:
|
|
- tar bort supercoils, öka linking number är mer korrekt
|
|
- kräver inte ATP
|
|
Typ II:
|
|
- Tar bort men kan också skapa, kräver ATP
|
|
|
|
---
|
|
Typ 1
|
|
|
|
Klyver ena strängen och tar bort ett varv i taget
|
|
- ändrar med en faktor av 1
|
|
- använder energi i spänningen
|
|
|
|
![[Pasted image 20251121104555.png]]
|
|
|
|
---
|
|
![[Pasted image 20251121104707.png]]
|
|
Typ II
|
|
- den klyver båda strängarna och låta en sträng
|
|
- låta en sträng komma igenom, den gör dubbelsträngat brott
|
|
- två varv i taget
|
|
- ändrar med en faktor av 2
|
|
---
|
|
|
|
![[Pasted image 20251121105233.png]]
|
|
|
|
Framför replikationsgaffeln sitter det topoisomeras II framför replikationsgaffeln och tar bort positiva supercoils
|
|
|
|
I bakterier kallas topoisomeras typ II ofta för Gyras. Gyras-hämmare är en viktig grupp av antibiotika! Tex. Ciprofloxacin för urinvägsinfektioner
|
|
de är bredspektrumantibiotika eftersom det är mot många
|