medical-notes/content/Slides.pdf.md

Kontroll av genuttryck i prokaryoter

Claes Gustafsson

(P)PPO

OH

OH

Deoxiribonukleotider (dNTP) bildas från ribonukleotider (NTP). Detta sker genom att NTP reducerars, d.v.s. förlorar sin OH-grupp i 2' -position.

Denna reaktion katalyseras av enyzmet ribonukleotidreduktas (RNR) -finns både hos prokaryoter och eukaryoter.

Base

(P)PPO

-0

Base

Ribonukleotidreduktas (RNR)

promoter operator

E

D

C

B

A

VAD ÄR EN GEN?

mRNA molecule

En nukleotidsekvens i DNA, som krävs för syntesen av ett fungerande protein eller en RNA-molekyl (inkl. tRNA, rRNA etc.)

I genen ingår även de reglersekvenser som bestämmer när och hur mycket av genen som skall tillverkas.

E. coli chromosome

gene A

• RNA

TRANSLATION

A

A A

A A

AAAAA

AAAAA

AAAAA

A A A AA

protein

Figure 7-2 Essential Cell Biology, 4th ed. (© Garland Science 2014)

IDNA

Olika gener uttrycks olika mycket

RNA

gene B

SONA

9000

Do0e

RNA polymerase holoenzyme

Transkriptionsinitiering

Promoter

Gene

000008

coding strand template strand

Figure 7-6 Essential Cell Biology, 4th ed. (© Garland Science 2014)

DNA

3'

Kodande sträng och mall-sträng

5'

3'

DNA of E. coli chromosome gene b

gene c gene f

gene g

3'

5'

Båda strängarna i DNA kan används som mall-sträng för RNA syntes. Figure 6-13 Molecular Biology of the Cell 6e (© Garland Science 2015)

gene a

RNA transcripts gene d

gene e

(A)

G

G

as a template

DNA double helix

Vilken sträng i DNA som skrivs av till RNA bestäms av den riktning som RNA-polymeraset rör sig

strand as a template

(B)

5

3

RNA syntetiseras alltid i 5' till 3' riktning.

Om man inte vet riktningen som RNApolymeraset rör sig så kan man inte veta vilken sträng som är mall-sträng

5'

3'

3'

5'

start site

gene

/

3] DNA

Promotorn bestämmer i vilken riktning RNApolymeraset skall transkribera! terminator template strand 3' 5' POLYMERASE CLAMPS DOWN ON DNA; RNA SYNTHESIS CONTINUES

En transkriptionsenhet är den sekvens i DNA som transkriberas till RNA.

gene

Startar vid promotorn och slutar vid terminatorn.

SIGMA

FACTOR

REBINDS

Figure 7-9 Essential Cell Biology, 4th ed. (© Garland Science 2014)

3'

stop site

promoter operator

Figure 7-12 Molecular Biology of the Cell 6e (® Garland Science 2015)

E

D

C

B

A

Hos bakterier kan en transkriptionsenhet bestå av flera gener Man brukar kalla en sådan enhet för ett ' operon '

• A

Det bildas ett långt mRNA som kodar för flera olika proteiner.

Gener ger upphov till proteiner involverade i samma metabola ' pathway ' återfinns i samma operon!

lac l

PO

lac Z

lac Y

lac A

I ett bakteriellt mRNA från ett operon finns många startplatser för translation! Vid AUG som skall användas för initiering finns speciella sekvenser i mRNA -s.k. Shine-Dalgarno sekvenser, som hjälper ribosomen att hitta rätt.

5'

SD AUG

Eukaryotic mRNA

5' cap initiation can only occur

at first AUG codon downstream of the 5' cap

AUG

SD AUG

SD AUG

Hur hittar bakteriellt RNApolymeraset till promotorn?

Subunit

Gene rpoA

гров

грос

rpoz

070

rpoD

and Company

W

E. coli RNA polymeras

Number

2

1

1

1

1

Mass (kDa)

37

151

155

10

70

Berg et al., Biochemistry, 9e, © 2019 W. H. Freeman	Berg et al., Biochemistry, 9e, © 2019 W. H. Freeman	Berg et al., Biochemistry, 9e, © 2019 W. H. Freeman

© 2019 Oxford University Press

•  (beta) är den katalytiska subenheten dvs. den som syntetiserar RNA i 5' till 3' riktning
•  (sigma) styr enzymet till promotorn (känner igen en särskild DNA-sekvens!)

THE CELL: A MOLECULAR APPROACH 8e, Figure 8.1

Sigma subenheten hjälper RNA-polymeraset att hitta till promotorn och påverkar enzymets allmänna egenskaper

Holoenzymet (innehåller sigma)

Kan hitta och specifikt binda till en promotor .

Binder svagt till icke-specifikt DNA -kräver promotorsekvens för att ' fastna '.

Hittar promotorn 10,000 gånger snabbare än kärnenzymet.











Kärnenzymet (saknar sigma)

Innehåller alla de subenheter av RNApolymeras om behövs för syntes av RNA.

Binder starkt till icke-specifikt DNA.

Har mycket svårt att hitta promotorer.

'



ana

00

00

THE CELL: A MOLECULAR APPROACH 7e, Figure 8.3 (Part 1)

© 2016 Sinauer Associates, Inc.

Polymerase bound

Bakteriellt RNA-polymeras glider längs DNA och letar efter en promotor. xanaxmana 000

Specific binding of a to

-35 and -10 promoter sequences

-35

-10 +1

3'

start site

promoter

→

Efter initiering släpper sigma-faktorn och RNApolymeraset fortsätter på egen hand.

POLYMERASE CLAMPS DOWN ON DNA;

RNA SYNTHESIS CONTINUES

TERMINATION AND RELEASE OF

BOTH POLYMERASE AND

COMPLETED RNA TRANSCRIPT

gene

5'

Figure 7-9 Essential Cell Biology, 4th ed. (© Garland Science 2014)

growing RNA transcript gene

/

SIGMA

FACTOR

REBINDS

stop site

Sigma factor

054

038

032

,28

024

Gene rpoD

rpoN

Function

Det finns sju olika sigma-subenheter som reglerar olika typer av gener

Gör det möjligt för bakterien att reglera uttryck av gener -kan välja att slå på eller av olika kombinationer av gener, beroende på situationen.

Det finns särskilda sigma faktorer för snabb tillväxt, för att skydda mot värmeshock, för att stimulera rörelse etc.

extreme heat stress (1)

dicitrate transport (26)

regulation of the fec genes for iron

fecl

DNA

Activator binding site

Repressor binding site

[Promoter Operator

Aktivatorer och repressorer

Figure 28-6

Lehninger Principles of Biochemistry, Sixth Edition

Nära promotorn finns bindningsplatser för proteiner som kan stimulera (aktivatorer) och stänga av (repressorer) transkription av alla dessa gener.

B

C

RNA polymerase

I ett typiskt operon återfinns en 'operator'.

P

Gene 1

Gene 2

Gene 3

Detta är en DNA-sekvens till vilken en repressor kan binda för att blockera initiering av transkription.

(ONA where repressor binds)

$ n mRNA made

mRNA

Tryptofan-operonet

• kodar för genprodukter som behövs för att bilda tryptofan

Trp operon

Tryptofan-operonet kodar för genprodukter (enzymer) som behövs för att bilda aminosyran tryptofan DNA

trpE

trpD

trpC

trpB

trpA

~

(where repressor binds)

Operator

LOW TRYPTOPHAN:

Finns det lite tryptofan i omgivningen så behöver operonet uttryckas.

Trp repressorn kan inte binda till operatorn och blockera transkription

P

TrpE

trpD

I trpC || trpB |trpA

DNA

HIGH TRYPTOPHAN:

Finns det mycket tryptofan i omgivningen så behöver inte dessa enzymer uttryckas.

Trp repressorn binder till operator-sekensen och blockerar transkription

• >

trpD

P

trpE

trpc trpB|/trpA

DNA

Tillgången på tryptofan reglerar tryptofanrepressorns aktivitet! tryptophan

GENES ARE ON

När E coli har god tillgång på tryptofan i mediet, binder det till repressorn och orsakar en konformationsförändring så att repressorn kan binda till operatorn.

Tryptofan fungerar som behövs för att repressorn skall vara aktiv!

Lac-operonet - kodar för genprodukter som

behövs för att bryta ner laktos

Glukos är förstahandsvalet som energikälla i bakterier.

När det finns mycket glukos i cellerna är alternativa sockerkällor avstängda så att cellen huvudsakligen förbränner glukos.

När det finns lite glukos i cellen kan arabinos, laktos eller andra sockermolekyler användas som energikällor.

Förklarar varför Lac-operonet i normalfallet är avstängt! Vill endast slås på när glukos saknas! Och endast i de fall det finns laktos att tillgå!

The lac operon:

Vid reglering av Lac-operonet samverkar en aktivator och en repressor lacz lacY lacA

polymerase binding I+

CAP är en blocks RNA

polymerase

Två krav för transkription av Lac-operonet!

1. Ingen repressor bunden till operatorn!
2. Ett aktivatorprotein (CAP) som stimulerar initiering av transkription!

bound activator protein

binding site

RNA polymerase

Aktivatorer stimulerar transkription

Underlättar inbindning av RNA-polymeras.

Kan öka transkriptionsnivån mer än 1000 gånger.

Vissa aktivatorer behöver en mindre molekyl, en så kallad co-aktivator som binder till aktivatorn för att den skall vara aktiv.

e

an

No lactose:

I närvaro av laktos så bildas allolaktos. Binder till repressorn och får den att släppa operatorn.

CAP site

Operator lacz lacy lacA

• Repressor

RNA Polymerase se

Observera skillnaden till trpoperonet!

lacZ lacy lacA

Lac-repressorn släpper operatorn när laktos finns närvarande i mediet. På det viset blockerar den inte längre transkription. Repressor

(vid trp-operonet fick tryptofan repressorn att binda!).

O

Low glucose:

N

N°

cAMP

Hur regleras aktiviteten hos aktivatorn, d.v.s. proteinet CAP? Promoter N

CAP

I frånvaro av glukos så bildas molekylen cAMP.

lacz high transcription

Binder till CAP, vilket får proteinet att fungera som en aktivator.

CAP

Operator lacz

low transcription

Cykliskt adenosinmonofosfat 'cAMP' signalmolekyl med många funktioner!

NH2

Aktivatorer och repressorer samverkar för att få reglerat genuttryck!

Hur kan aktivatorn (CAP) samverka med repressorn för att få reglerat genuttryck från lac-operonet?

Glucose present, lactose absent:

I närvaro av glukos används inte lac-operonet. Även om laktos finns i omgivningen!

CAP site

Operator lacz

RNA Polymerase Repressor

Glucose present, lactose present:

CAP

Glukos är alltid bakteriens förstahandsval!!

CAP site

Operator

RNA Polymerase

Repressor

Glucose absent, lactose absent:

I frånvaro av glukos slås lac-operonet på! Men bara om det finns laktos i omgivningen!

CAP site

Operator lacz

RNA Polymerase Repressor

Glucose absent, lactose present:

cAMP

CAP

CAP site lacY

lacA

RNA Polymerase

Antibiotika

• För biologer är det ämnen som producerats av levande organismer i syfte att hålla andra organismer borta.
• Inom medicinen kan dessa medel användas för att. behandla infektioner, men också vid cancersjukdom.

Principer för antibiotikas effekt -två exempel 1. Blockera initiering av transkription

Rifampicin binder till beta-subenheten i det bakteriella RNA polymeraset och blockerar elongering.

Används t.ex. vid behandling av tuberkulos

(A)

(B)

N-MeGly

D-Val

D-Val

Principer för antibiotikas effekt -två exempel 2. Interkalation Thr

Actinomycin lägger sig mellan basparen i DNA.

Berg et al., Biochemistry, 9e, © 2019 W. H. Freeman and Company

'interkalation'

Stör t.ex. Transkription och DNA replikation

Används vid cancerbehandling t.ex. ovarialcancer

Pro

Pro

Det finns speciella virus som bara infekterar bakterier -Bakteriofager

Icosahedral phage

(corticovirus)

Bakteriofager infekterar bakterien och utnyttjar cellen för att skapa många nya kopior -bakterien dödas i en s.k. lytisk cykel

E. coli cell

ox xxx

MRNA COVID VACCINES

Bakteriofag T7 RNA-polymeras används i ren form för att producera mRNA-vacciner mot t.ex. COVID. COVID

spike protein

Human cell