Johan Dahlin
81790199af
All checks were successful
Deploy Quartz site to GitHub Pages / build (push) Successful in 2m4s
230 lines
6.3 KiB
Markdown
230 lines
6.3 KiB
Markdown
# Att utforska proteiner
|
||
**Sahlgrenska Akademin – LPG001 Biokemi – 2025-11-17**
|
||
**Linda Johansson, Ph.D. – linda.johansson.4@gu.se**
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Innehåll
|
||
- Begreppet ”proteom”
|
||
- Skillnader i proteiners kemiska och fysikaliska egenskaper och hur dessa ligger till grund för olika reningsprinciper:
|
||
- gelfiltrering
|
||
- jonbyteskromatografi
|
||
- affinitetskromatografi
|
||
- Principer och tillämpning av elektrofores (SDS-PAGE)
|
||
- Översiktlig beskrivning av proteinanalys med immunologiska tekniker och ”blottning”
|
||
- antikroppar och antigen
|
||
- skillnad mellan monoklonala och polyklonala antikroppar
|
||
- principen för ELISA
|
||
- kliniska exempel
|
||
- Masspektrometri – introduktion
|
||
- Förutsättningar för proteinstrukturbestämning med:
|
||
- röntgenkristallografi
|
||
- NMR
|
||
- kryo-EM
|
||
och deras medicinska applikationer
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Varför studera proteiner?
|
||
- Forskning:
|
||
- strukturbiologi – hur proteiner ser ut
|
||
- biokemi – vad de binder
|
||
- var de finns i kroppen
|
||
- hur de påverkar sjukdomar
|
||
- Klinik:
|
||
- HIV-test (antikroppar, ELISA)
|
||
- COVID-19 (antigen, antikropp, ELISA)
|
||
- Myelom (detektion av IgM med proteinelektrofores)
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Proteiner
|
||
- Proteiner utför viktiga funktioner i de flesta biologiska processer, t.ex. DNA-replikation och signalöverföring.
|
||
- Sensoriska funktioner som smak, lukt, temperatur och beröring bygger på proteiner.
|
||
- Aminosyrasekvensen bestämmer konformationen (3D-strukturen) och därmed funktionen.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Proteiner – 2024 års Nobelpris
|
||
- Handlar om proteiners strukturer och hur de kan designas och förutsägas.
|
||
- David Baker: byggt helt nya proteiner.
|
||
- Demis Hassabis & John Jumper: AI-modellen AlphaFold som löser strukturförespådningsproblemet.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Genom vs proteom
|
||
- **Genom:** komplett DNA-sekvens (~3 miljarder baser, ca 23 000 gener).
|
||
- **Proteom:** de proteiner som uttrycks av en cell vid en given tidpunkt.
|
||
- Proteomet påverkas av:
|
||
- celltyp
|
||
- tidpunkt
|
||
- proteininteraktioner
|
||
- posttranslationella modifieringar
|
||
- Proteomet är mycket dynamiskt och komplext.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Hur kan vi studera proteiner?
|
||
- Vi behöver rena fram ett specifikt protein ur cellens innehåll.
|
||
- Proteiner skiljer sig i:
|
||
- storlek
|
||
- laddning
|
||
- löslighet
|
||
- bindningsaffinitet
|
||
- Egenskaperna används i reningsmetoder.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Preparation av protein – homogenisat
|
||
- Celler bryts upp → homogenisat.
|
||
- Centrifugering separerar komponenter:
|
||
- **pellet:** i botten
|
||
- **supernatant:** ovanför
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Kromatografi – princip
|
||
- Små kulor/beads med definierade egenskaper packas i en kolonn (fast fas).
|
||
- Buffert + prov rör sig genom kolonnen (mobil fas).
|
||
- Olika typer används beroende på proteinets egenskaper.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Gelfiltrering – separation efter storlek
|
||
- Porösa kulor släpper in små molekyler men inte stora.
|
||
- **Stora proteiner kommer ut först.**
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Jonbyteskromatografi – separation efter laddning
|
||
- Proteinets totala laddning styr bindning.
|
||
- **Anjonbytare:** binder negativa grupper.
|
||
- **Katjonbytare:** binder positiva grupper.
|
||
- Eluering sker med pH-ändring eller saltgradient.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Affinitetskromatografi – separation efter selektivitet
|
||
- Specifik bindning mellan protein och ligand.
|
||
- Exempel: 6×His-tag → stark bindning till Ni²⁺-kolonn.
|
||
- Eluering ofta med imidazol.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Analys av proteinrening
|
||
- Flera reningssteg kombineras.
|
||
- Man följer renheten vid varje steg.
|
||
- Val av metod beror på:
|
||
- önskad renhet
|
||
- proteinets egenskaper
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Gelelektrofores – princip
|
||
- Molekyler med nettoladdning vandrar i elektriskt fält.
|
||
- Polyakrylamidgel separerar efter storlek.
|
||
- Små proteiner rör sig snabbare.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## SDS-PAGE
|
||
- SDS ger uniform negativ laddning proportionell mot massa.
|
||
- Separation sker enbart på **storlek**.
|
||
- Efter körning färgas gelen (Coomassie blue).
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## SDS-PAGE i reningskontroll
|
||
- Prover tas efter varje reningssteg.
|
||
- Rätt band ska bli tydligare och renare för varje steg.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Gelfiltrering vs SDS-PAGE
|
||
- **Gelfiltrering:** störst först, används för rening.
|
||
- **SDS-PAGE:** minst först, används för analys.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Antikroppar och antigen
|
||
- Antikroppar → proteiner som känner igen antigen.
|
||
- Del av antigenet som känns igen = **epitop**.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Monoklonala vs polyklonala antikroppar
|
||
- **Monoklonala:** känner igen exakt samma epitop.
|
||
- **Polyklonala:** mix som känner igen flera epitoper på samma antigen.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## ELISA – princip
|
||
- Enzymbundet antikroppssystem som ger färg vid substrattillsats.
|
||
- Två huvudtyper:
|
||
- **Indirekt ELISA:** detekterar antikroppar (t.ex. HIV)
|
||
- **Sandwich ELISA:** detekterar antigen (t.ex. COVID-19)
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Western Blot
|
||
- SDS-PAGE → proteiner förs över till membran.
|
||
- Inkuberas med primär + sekundär antikropp.
|
||
- Signal mäts via enzym eller fluorescens.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Masspektrometri – princip
|
||
- Identifierar peptider/proteiner.
|
||
- Möjliggör analys av posttranslationella modifieringar.
|
||
- Peptider joniseras → accelereras → separeras efter massa (t.ex. MALDI-TOF).
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Masspektrometri – användning
|
||
- Identifiera proteiner
|
||
- Verifiera rening
|
||
- Kartlägga PTM
|
||
- Analysera sekvens och evolutionärt ursprung
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Proteiners 3D-struktur
|
||
- Bestäms av aminosyrasekvens.
|
||
- Experimentella metoder krävs ofta trots AI-prediktioner som AlphaFold.
|
||
- Struktur är centralt för läkemedelsutveckling.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## NMR
|
||
- Baserad på magnetiska atomkärnor.
|
||
- Resonans påverkas av atomernas omgivning.
|
||
- Typer:
|
||
- 1D NMR – veckningsinformation
|
||
- NOESY – avstånd mellan protoner (<5 Å)
|
||
- Begränsning: protein <50 kDa
|
||
- Resultat: ensemble av möjliga strukturer.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Röntgenkristallografi
|
||
- Proteinet kristalliseras.
|
||
- Kristall bestrålas med röntgen → diffraktionsmönster samlas.
|
||
- Matematiskt → elektrondensitetskarta → modell av struktur.
|
||
- Hög upplösning ger mer detaljer.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Kryo-EM
|
||
- Direkt visualisering av frys-införda molekyler.
|
||
- Kräver inga kristaller eller isotoper.
|
||
- Single-particle-analys möjlig.
|
||
- Snabb metodutveckling → dominerande teknik idag.
|
||
- Upplösning beror på proteinets storlek.
|
||
- Nobelpris 2017.
|
||
|
||
---
|
||
|
||
## Kryo-EM – procedur
|
||
- Protein fryses på grid i flytande helium.
|
||
- Exponeras för elektronstråle i vakuum.
|
||
- Många 2D-bilder sammanställs → 3D-struktur. |