medical-notes/content/Biokemi/Cellulära processer/DNA replikation/Anteckningar.md

---
tags:
  - biokemi
  - dna-replikation
  - anteckningar
föreläsare: Claes Gustavsson
---

- En jämförelse mellan eukaryota och prokaryota genom
	- mycket är lika!
- Grundläggande enzymatiska processer vid eukaryot DNA replikation (mycket lik prokaryot!)
	- dyker upp i läkemedel

Föreläsningen täcker bl.a.:
- Leading och Lagging strand
- Processivity och proofreading
- Replikationsgaffel och replisome
- Superhelicitet och topoisomeraser
- Nukleaser och ligaser


----
![[Pasted image 20251121091934.png]]
Bakterier har eget genom
- **Cirkulärt**
	- vissa problem med linjär replikation av ändar
	- fördelar, bara gå runt
- 500kbp till 11Mbp
- **Plasmider**
	- samma typ av DNA, mindre och kan överföras mellan baktirer t.ex. antibiotikaresistens
- Har ett genom

FRÅGA: varför har människor inte plasmider för att överföra fördelar?


---
Eukaryota
![[Pasted image 20251121092321.png]]
 - 30-100 ggr så större än bakteriella
- 3 Gbp
- Egna problem att det är så stort och linjärt
----

Bra att lära sig: 
- DNA replikeras
- RNA transkription
- Protein translation

![[Pasted image 20251121092516.png]]

----
Redan Watts insåg att det var semi-konservativt så fort de förstod hur det såg ut.
Då blev allt väldigt uppenbart

Genom att titta så förstod man funktion, var komplimentära, samma information fanns i båda molekylerna
![[Pasted image 20251121092705.png]]

Viktigt: 
- semi-konservativ som begrepp
- föräldrasträngen är den blå (parental)
- nybildadsträng är den röda (nascent)

---

![[Pasted image 20251121092822.png]]

Krångligt att rita ut helixarna, blir linjärt för förenkling

Man börjar på många olika ställen
- bildar replikationsbubblor
- sen växer bubblorna åt båda hållen
- så småningom når det varandra, då går de ihop och då får vi nya strängar

Bubblorna startar vid "origin of replication" och är **många**, som är väl definierade, väl reglerade
Många sjukdomar beror på för mycket/lite dna, eller skapat dna,
jättereglerat, en gång, det måste ske samtidigt över hela molekylen.

Varje bubbla har två replikationsgafflar

----
![[Pasted image 20251121093320.png]]
Bakteriell DNA behöver inte så många replikationsgafflar
Har bara **ett** origin of replikation

----

Hur går det till att läsa av båda två strängarna i samma riktining?

----
![[Pasted image 20251121093608.png]]

- föräldrasträngarna är antiparallela (övre)
- undre är inga problem, mall och så bygger man en i taget
- Mallsträngen går från 3' till 5' felaktig
	- behöver en nödläsning
	- gör korta snuttar
	- lägga en ny som går bakåt

Så
- en kontinuerligt
- en med små korta snuttar


---
![[Pasted image 20251121093757.png]]
Man brukar prata om två olika
- kontinuerligt: leading strand
- små fragment: lagging strand
	- varje fragment heter okazaki fragment
	- döpt efter en japansk gästforskare på stanford
	- 100-200 nukleotider i eukaryoter
	- 1000-2000 i prokaryoter

FRÅGA: varför storleks skillnad mellan eukaryoter och prokaryoter?

---
![[Pasted image 20251121094040.png]]
Måste ske av ett helt enzymmaskineri
För att lyckas så måste vi ha ett antal enzymer
te.x ett som hjälper till att dela
skillnad mot RNA:
- bubblan öppnar bara upp en liten bit
- kräver mycket mer kraft krävs (helikas)
- polymeras för att sätta på
	- krävs en för både lagging och leading

---
![[Pasted image 20251121094218.png]]
Viktigaste enzymet!
DNA-polymeras
- hjälpa till och skapa en struktur
- nya nukleotider som kan baspara
- kallas DNA-syntes
- DNA-polymeraset hjälper till att välja ut rätt nukleotid
- kan hamna snett, när det inte sitter perfekt så bildas det inget nytt fosfodiesterbindning
- när rätt nukleotid är på plats, nu verkar allt stämma då sker det en liten ändring i strukturen - click säger det och kopplar på i den nya kedjan
	- får energi av fosfatgrupperna som trillar av ATP
	- då öppnar sig DNA-polymeraset och rör sig en liten bit

FRÅGA: krävs det ett ATP per replikerad nukleotid?

----
Magnesiumjoner hjälper DNA-polymeraset att sätta fast nya nukleotider
SLIDE SAKNAS

interaktion med magnesiumjoner, hjälper till att lägga så allt ligger väldigt nära varandra
det hjälper till att få en reaktion
skapa en ny fosfodiesterbindnig

---
![[Pasted image 20251121094606.png]]
påminner om en högerhand som växer

---
![[Pasted image 20251121094625.png]]
kärnpunkten i vad DNA-polymeras behöver göra

När det inte funkar kan man få väldigt tråkiga sjukdomar, t.ex. sjukdom vid 13 och går bort vid 20. I mitokondrier, talar mer om det i T3

Cancer orsakas pga av mutation, då man inte kan mutera DNA på rätt sätt.

DNA-polymeraset måste vara
- noggrant - kallas även **fidelitet**
	- annars mutationer och kanske sjukdomar
- effektivt - kallas **processivitet**
	- måste fungera på väldigt långa sträcker, vara väldigt noggrant och en hög processivitet, långa sträcker utan att falla av

----
![[Pasted image 20251121094943.png]]

Ibland blir det fel, kommer in en felaktig nukleotid

Det finns en möjlighet för DNA-polymeraset att fixa det, det har inte bara
- att röra sig framåt
- men har också möjligheten att backa
- exonukleoasaktivtet (ta bort ifrån änden)

Förmågan att backa kallas proofreading

----

SLIDE endonukleaser/exonukleaser saknas

----

endonukleas 
- ta bort i mitten
exonukleas kan delas upp i två grupper
- ta bort i en ände
	- 5' 
	- 3' 
---

![[Pasted image 20251121095304.png]]

Måste vara processiva (effektiva!)
Miljoner, miljarder baspar som måste replikeras
Måste köra under en lång tid

Processivitet = förmågan att koppla på **många** nukleotider till den **växande** DNA-strängen, utan att polymeraset **lossnar** från mallsträngen.

sliding camp - klämma
- sätter sig fast i änden
- fungerar som ett ankar som håller kvar DNA
- ökar effektivtet 50ggr för att DNA-polymeraset inte lossnar
	- utan: 10-20 nt/s
	- med: 500-1000nt/s

----
**Problem vid DNA-replikation (2)**
DNA-polymeraser kan inte starta DNA replikation _de novo_. De behöver en primer.

de novo = från ingenting

----
![[Pasted image 20251121095710.png]]
För att börja, behöver vi en liten startpunkt som är en RNA primer.

RNA-polymeras kan startas **de novo**
DNA-polymeras behöver en RNA-primer

Finns ett specialiserat DNA-polymeras som bara gör väldigt korta strängar, behöver bara en liten snutt, som det vanliga DNA-polymeraset kan starta och köra igång
- det kallas för DNA-primas

I våra celler sitter DNA-polymeras tillsammans med DNA-primas (kommer senare)

----
![[Pasted image 20251121095938.png]]

leading strand: primers behövs bara en primer 
lagging strand: en primer per fragment
FRÅGA: hur lång är en fragment
FRÅGA: varför kan man inte bygga bakvänt?
- har med fosfatbryggan, naturen har valt att göra det
FRÅGA: plockas primern bort?
- vi vill inte ha RNA i DNA
- vi vill inte ha en lucka

---

Problem vid DNA-replikation (3)
På lagging-strängen finns en RNA-primer i början av varje Okazaki-fragment!
Vi vill inte ha sträckor av RNA i DNA-molekylen!

---

Energin kommer med den inkommande nukleotiden
det bestämmer att reparation måste gå i rätt riktning
trifosfater är lite instabila, de kan gå sönder, sitter de på DNA-kedjan kan det bli katastrof.

okazaki-fragement kan variera i längd, när de nått en viss längd så lossnar maskineriet

----
![[Pasted image 20251121102046.png]]

VIll ta bort - fragement maturation
- steg 1 RNA-primer
- steg 2 brytpunkten, DNA-fragmenten måste sitta ihop ordentligt
	- försluter ryggraden så den blir hel
	- kallas ligering - klistrar ihop fragmenten
		- får inte finnas brott (nicks)

----

![[Pasted image 20251121102319.png]]

#### Steg 1

Från vänster närmare sig det nya fragmentet
DNA polymerases stannar inte, det krashar in i RNAt, när det händer så släpper det från DNA, de sitter inte längre hybridiserat. Bildar en lite flärp, flap. Som petar ut det här RNA, medan DNA finns kvar på strängen

Finns ett speciellt endonukleas som känner igen detta flappar, kallas Flap Endonukleass 1 eller FEN1 som kan komma in och klyva.
Sen finns det bara en litet nick kvar, allt RNA är borta.
Det är eukaryota celler när vi ta bort

---
### Steg 2

![[Pasted image 20251121102545.png]]
Använder energi från ATP för att laga nicken, det är DNA-ligas som lagar.
Själva nicken är avsaknaden av en fosfodiesterbrygga, alla nukleotider finns men en brygga saknas.

----
![[Pasted image 20251121102658.png]]
Använder ATP som en ko-faktor som kan klistras ihop.

---
**Problem vid DNA-replikation (4)**

DNA är dubbelsträngat! Hur kan vi dela på strängarna så att DNA replikation kan ske?

---


![[Pasted image 20251121102747.png]]



Helikas är en grupp av enzym:
- en förmåga att dela DNA
- finns olika beroende på process

I DNA-replikationen sitter helikaset längst fram, det är det som gör att gaffeln kan röra sig.
- det binder till en av strängarna, fungerar som en kil
- klättrar på en sträng, så pressar det isär DNA som finns framför
-

----
![[Pasted image 20251121102941.png]]
- Består av 6 st identiska subenheter
- Den bildar runt DNA
- Har förmåga att klättra som en repklättrare
- Hydroliserar ATP använder energi från det
- den rör sig upp för det här och så växer gaffel, så går den längre och längre uppför
- klättrar utmed
- snurrar runt lite här
- alla olika subenheter kan hydrolisera ATP, det blir som en rörelse uppåt

På leadning strand sitter DNA-pol en liten bit efter
För lagging strand är det lite mer komplicerat, måste finns upp till 200 nt lång sträcka innan man syntesiserar, måste skydda DNA i den biten, känsligt för omgivningen, mycket som reagera, som går in och basparar med sig själv
Måste stabilisera det enkelsträngade DNA så inte det sker

Kallar de för enkelsträngadeproteiner

---

![[Pasted image 20251121103232.png]]

Allt det här stimulerar DNA-replikation, för att det ska kunna ske effekivt
I de flesta celler kallar det single-cell-binding protein

Replication Protein A kallas det i våra celler RPA, spelar en viktig roll här.

---
![[Pasted image 20251121103336.png]]
Proteinerna fungerar tillsammans som ett maskineri, de viktig att alla är på plats tillsammans
Ofta bildar de interaktioner mellan varandra
Helikaset känner av att det finns ett single-stranding DNA binding, de stimulerar **varandra** så de vågar röra sig framåt, de blir mer effektivt.
Om man återskapar det här i ett provrör, om man lägger till ett single-stranding DNA.

----

www.youtube.com/watch?=l9ArIJWYZ

---

**Problem vid DNA-replikation (5)**

När man tvingar isär dubbelhelixen så skapas topologiska problem.

Varför och hur löser cellen detta?

----
När vi gör en DNA-replikation kan snörerna svängarna/helixarna, har ingenstans att ta vägen, de kommer bli massa spänningar i det här DNA. Tänk skosnöre som är tvinnat.
Man kan inte förvänta sig att det ska lösa sig självt.

![[Pasted image 20251121103747.png]]

Det blir massa spänningar och jobbigt, massa konstiga sekundärstrukturer.
Som heter **supercoils**

Det blir mkt motstånd, måste bli av med spänningarna, behöver någonting framför för att slappna av DNA:t

----

![[Pasted image 20251121103912.png]]

Går inte att snurra DNA-molekylerna, de blir fixerade och tar man bara helikaset.
Ju mer man kör ju mer spänningar, konstiga strukturer, stannar replikationen.
Får detta att slappna av.

---
Linking DNA


- Har ungefär 10.4 bp/varv. Fin avslappnad och optimerad DNA-helix.
- 160bp lång, får plats med 25 varv
![[Pasted image 20251121104100.png]]

Man kan slå ihop de, så blir de så fint här:
![[Pasted image 20251121104106.png]]

Men vad händer om man introducerar 5 extra varv, då bygger vi upp spänningar i molekylen.
Linking Number (Lk) är antal varv, det ska motsvara det optimera och helst vara 25 varv för 160 bp
- vad händer om det är mer eller mindre
- då förstör man DNA, det skapar topologisk stress

Stress = fler antal varv än DNA strängarna

----
Topoismeraser är de som tar bort spänningarna i DNA.

Det är specilla enzymer.
topo=läge
iso=samma
meris=del
-as=enzym

Typ I:
	- tar bort supercoils, öka linking number är mer korrekt
	- kräver inte ATP
Typ II:
	- Tar bort men kan också skapa, kräver ATP

---
Typ 1

Klyver ena strängen och tar bort ett varv i taget
- ändrar med en faktor av 1
- använder energi i spänningen

![[Pasted image 20251121104555.png]]

---
![[Pasted image 20251121104707.png]]
Typ II
- den klyver båda strängarna och låta en sträng 
- låta en sträng komma igenom, den gör dubbelsträngat brott
- två varv i taget
- ändrar med en faktor av 2
---

![[Pasted image 20251121105233.png]]

Framför replikationsgaffeln sitter det topoisomeras II framför replikationsgaffeln och tar bort positiva supercoils

I bakterier kallas topoisomeras typ II ofta för Gyras. Gyras-hämmare är en viktig grupp av antibiotika! Tex. Ciprofloxacin för urinvägsinfektioner
	de är bredspektrumantibiotika eftersom det är mot många