vault backup: 2025-11-28 11:09:35

content/Biokemi/Plasmidlabb/Förståelse.md

@@ -12,4 +12,78 @@ Klyvning kan ge två typer av ändar: sticky ends (överhängande ändar) och bl
 
 E. coli används eftersom den växer snabbt, är lätt att odla och genetiskt manipulera, och vi känner dess genom mycket väl.
 
+### Dag 1 & 2:
+- Genen lacZ i E. coli kodar för enzymet β-galaktosidas
+- IPTG är en inducer som behövs för att slå på lacZ, så att enzymet faktiskt bildas
+- X-gal är ett konstgjort substrat, som blir blått när de klyvs av β-galaktosidas
+- X-gal och 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-Galactopyranoside är samma sak
+- Normalt klyver enzymet β-galaktosidas X-gal → blått färgämne bildas
+- För att substratet ska bli blått krävs lacZ, IPTG och X-gal. Saknas några av dem blir det inte blått
+- Ampicillin dödar bakterier som inte har plasmiden, så bara de vi vill studera överlever.
+- Heat-shock 0->37 grader skapar en tryckskillnad och öppnar porer i membrandet så plasmid-DNA kan ta sig in i cytoplasman
+	- Nerkylning direkt efteråt gör att de stannar kvar
+- LB-plattan är både odlingsmedium och selektions-/screeningsverktyg
+	- näring (aminosyror, mineral, salt, tillväxtfaktorer osv)
+	- ampicillin dödar allt utan plasmid
+	- IPTG slår på lacZ
+	- X-gal infärgning
 
+### Dag 3
+
+#### A. Förbered plasmiden
+
+Cellerna centrifugeras, spräcks och plasmiden separeras från cellskräpet. Plasmiden fångas sedan upp i en spin-kolonn, tvättas ren och sköljs ut i en ny tub.
+
+![[Pasted image 20251128104012.png]]
+
+Vi har två lösningar i separata falkonrör, en blå (utan våran insert) och en vit (med vår insert). Upprepa alla stegen för varje lösning.
+
+| Steg            | Input                | Output                                 | Kort beskrivning                                                |
+| --------------- | -------------------- | -------------------------------------- | --------------------------------------------------------------- |
+| 1. Pelletera    | Bakteriekultur       | Cellpellet + borttagen supernatant     | Celler centrifugeras ned till botten.                           |
+| 2. Lös upp      | Cellpellet + A1      | Jämn cellsuspension                    | Löser upp pelleten så lysering kan fungera.                     |
+| 3. Lysera       | Cellsuspension + A2  | Lyserad lösning                        | Cellmembran öppnas, plasmid + DNA/proteiner frigörs.            |
+| 4. Neutralisera | Lyserad lösning + A3 | Fällt skräp + plasmid i lösn.          | Stora DNA/proteiner klumpar ihop sig. Plasmiden stannar löslig. |
+| 5. Centrifugera | Neutraliserad mix    | Pellet (skräp) + supernatant (plasmid) | Plasmiden separeras från cellskräp.                             |
+| 6. Ladda kolumn | Supernatant          | Plasmid bundet till kolumn             | Plasmiden fastnar på membranet; skräp rinner igenom.            |
+| 7. Tvätta       | Kolumn + A4          | Renad kolumn                           | Tar bort salter, proteiner och kvarvarande föroreningar.        |
+| 8. Torka kolumn | Tvättad kolumn       | Torr kolumn                            | Extra spinn för att avlägsna etanolrester.                      |
+| 9. Skölj        | Kolumn + vatten      | Ren plasmid-DNA i eppendorf            | Vattnet löser av plasmiden från membranet.                      |
+Vi får nu ut en ren plasmid
+
+#### B. klyv plasmiden med BamHI och jämför den med en oklippt kontroll.
+
+Skapa en BamHI-enzym som kan klippa plasmiden, klipp plasmiden och tillsätt färgnings
+
+Master solution:
+- vatten, buffert och enzym blandas in
+
+Digested = cut = plasmid som har blivit klippt vid BamHI-sajten
+Cybr safe gör det synligt i UV-ljus utan att vara cancerframkallande
+loading dye gör att vi kan se vad vi pipeterar in i elektroforesen i nästa steg
+
+![[Pasted image 20251128104645.png]]
+
+
+| Steg                          | Input                     | Output                           | Kort beskrivning                                     |
+| ----------------------------- | ------------------------- | -------------------------------- | ---------------------------------------------------- |
+| 1. Gör BamHI-mastermix        | H₂O + 10× buffer + BamHI  | Färdig enzymmix                  | Blandar så alla prover får samma enzym och buffer.   |
+| 2. Fördela plasmider          | Plasmid-DNA               | Tub “white-cut” + tub “blue-cut” | Flyttar plasmiderna till nya rör för klippning.      |
+| 3. Tillsätt master + inkubera | Plasmid + BamHI-mastermix | Digesterat (klippt) DNA          | Enzymet klipper plasmiden vid BamHI-sajten.          |
+| 4. Tillsätt loading dye       | Klippt DNA + dye          | Färdiga “cut”-prover för gel     | Gör proverna tyngre och synliga i gelen.             |
+| 5. Gör oklippta kontroller    | Plasmid + loading dye     | “white-uncut” + “blue-uncut”     | Referensprover som visar hur odigesterat DNA ser ut. |
+
+Du blandar en BamHI-lösning, blandar den med plasmiderna och låter enzymet klippa DNA:t vid 37 °C. Sedan tillsätter du loading dye och gör även två oklippta kontroller för jämförelse i gelen.
+
+
+#### Steg 3
+
+Elektrofoera och läs av i UV-ljus
+
+![[Pasted image 20251128104949.png]]
+
+| Steg                         | Input                       | Output                           | Kort beskrivning                              |
+| ---------------------------- | --------------------------- | -------------------------------- | --------------------------------------------- |
+| 7. Ladda prover              | Marker + cut/uncut-prover   | Gel med laddade prover           | Proverna placeras i rätt ordning i brunnarna. |
+| 8. Kör elektrofores          | Gel i tank + 120 V          | Separering av DNA-fragment       | DNA vandrar efter storlek genom gelen.        |
+| 9. Fotografera               | Färdigkörd gel              | UV-bild med DNA-band             | Bandmönstret visar plasmidens storlek/insätt. |