medical-notes/content/Biokemi/Plasmidlabb/Förståelse.md

Vektorer är DNA-molekyler (t.ex. plasmider) som har specifika klipp- och infogningsställen där man kan sätta in gener för kloning eller uttryck.

När man klipper DNA använder man restriktionsenzymer, som känner igen och klyver specifika sekvenser.

MCS (multiple cloning site) är en kort DNA-region i en vektor som innehåller många unika restriktionsställen där man kan klippa och sätta in gener.

Man ligerar DNA med DNA-ligas, ett enzym som kopplar ihop ändarna genom att skapa fosfodiesterbindningar.

BamH I är ett restriktionsenzym

Klyvning kan ge två typer av ändar: sticky ends (överhängande ändar) och blunt ends (trubbiga ändar).

E. coli används eftersom den växer snabbt, är lätt att odla och genetiskt manipulera, och vi känner dess genom mycket väl.

Dag 1 & 2:

• Genen lacZ i E. coli kodar för enzymet β-galaktosidas
• IPTG är en inducer som behövs för att slå på lacZ, så att enzymet faktiskt bildas
• X-gal är ett konstgjort substrat, som blir blått när de klyvs av β-galaktosidas
• X-gal och 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-Galactopyranoside är samma sak
• Normalt klyver enzymet β-galaktosidas X-gal → blått färgämne bildas
• För att substratet ska bli blått krävs lacZ, IPTG och X-gal. Saknas några av dem blir det inte blått
• Ampicillin dödar bakterier som inte har plasmiden, så bara de vi vill studera överlever.
• Heat-shock 0->37 grader skapar en tryckskillnad och öppnar porer i membrandet så plasmid-DNA kan ta sig in i cytoplasman
  • Nerkylning direkt efteråt gör att de stannar kvar
• LB-plattan är både odlingsmedium och selektions-/screeningsverktyg
  • näring (aminosyror, mineral, salt, tillväxtfaktorer osv)
  • ampicillin dödar allt utan plasmid
  • IPTG slår på lacZ
  • X-gal infärgning

Dag 3

A. Förbered plasmiden

Cellerna centrifugeras, spräcks och plasmiden separeras från cellskräpet. Plasmiden fångas sedan upp i en spin-kolonn, tvättas ren och sköljs ut i en ny tub.

!

Vi har två lösningar i separata falkonrör, en blå (utan våran insert) och en vit (med vår insert). Upprepa alla stegen för varje lösning.

Steg	Input	Output	Kort beskrivning
1. Pelletera	Bakteriekultur	Cellpellet + borttagen supernatant	Celler centrifugeras ned till botten.
2. Lös upp	Cellpellet + A1	Jämn cellsuspension	Löser upp pelleten så lysering kan fungera.
3. Lysera	Cellsuspension + A2	Lyserad lösning	Cellmembran öppnas, plasmid + DNA/proteiner frigörs.
4. Neutralisera	Lyserad lösning + A3	Fällt skräp + plasmid i lösn.	Stora DNA/proteiner klumpar ihop sig. Plasmiden stannar löslig.
5. Centrifugera	Neutraliserad mix	Pellet (skräp) + supernatant (plasmid)	Plasmiden separeras från cellskräp.
6. Ladda kolumn	Supernatant	Plasmid bundet till kolumn	Plasmiden fastnar på membranet; skräp rinner igenom.
7. Tvätta	Kolumn + A4	Renad kolumn	Tar bort salter, proteiner och kvarvarande föroreningar.
8. Torka kolumn	Tvättad kolumn	Torr kolumn	Extra spinn för att avlägsna etanolrester.
9. Skölj	Kolumn + vatten	Ren plasmid-DNA i eppendorf	Vattnet löser av plasmiden från membranet.
Vi får nu ut en ren plasmid

B. klyv plasmiden med BamHI och jämför den med en oklippt kontroll.

Skapa en BamHI-enzym som kan klippa plasmiden, klipp plasmiden och tillsätt färgnings

Master solution:

• vatten, buffert och enzym blandas in

Digested = cut = plasmid som har blivit klippt vid BamHI-sajten Cybr safe gör det synligt i UV-ljus utan att vara cancerframkallande loading dye gör att vi kan se vad vi pipeterar in i elektroforesen i nästa steg

!

Steg	Input	Output	Kort beskrivning
1. Gör BamHI-mastermix	H₂O + 10× buffer + BamHI	Färdig enzymmix	Blandar så alla prover får samma enzym och buffer.
2. Fördela plasmider	Plasmid-DNA	Tub “white-cut” + tub “blue-cut”	Flyttar plasmiderna till nya rör för klippning.
3. Tillsätt master + inkubera	Plasmid + BamHI-mastermix	Digesterat (klippt) DNA	Enzymet klipper plasmiden vid BamHI-sajten.
4. Tillsätt loading dye	Klippt DNA + dye	Färdiga “cut”-prover för gel	Gör proverna tyngre och synliga i gelen.
5. Gör oklippta kontroller	Plasmid + loading dye	“white-uncut” + “blue-uncut”	Referensprover som visar hur odigesterat DNA ser ut.

Du blandar en BamHI-lösning, blandar den med plasmiderna och låter enzymet klippa DNA:t vid 37 °C. Sedan tillsätter du loading dye och gör även två oklippta kontroller för jämförelse i gelen.

Steg 3

Elektrofoera och läs av i UV-ljus

!

Steg	Input	Output	Kort beskrivning
7. Ladda prover	Marker + cut/uncut-prover	Gel med laddade prover	Proverna placeras i rätt ordning i brunnarna.
8. Kör elektrofores	Gel i tank + 120 V	Separering av DNA-fragment	DNA vandrar efter storlek genom gelen.
9. Fotografera	Färdigkörd gel	UV-bild med DNA-band	Bandmönstret visar plasmidens storlek/insätt.