medical-notes/content/Biokemi/🔬 Plasmidlabb/Anteckningar I.md

föreläsare, tags

föreläsare	tags
Oliver Forsell	biokemi anteckningar rekombinant-dna-teknik

Rekombinant DNA-teknik

Steg

• Molekylär kloning
  • använder sig av en DNA snutt, en reflektionsenzym
  • foga in det i en slags vektor, ofta i en plasmid
  • Samma plasmid har förmåga klippa iihop samma baspar
  • foga ihop sin DNA
    • med hjälp av vegasenzym
• Transformationen
  • För in den här vektor i en värd-cell
• Selektera och replikera
  • Växa den i fermentortankar, så man får tillräckligt mycket av sitt material

Plasmider

Dubbelsträngat ciruklärt DNA, finns i de flesta bakterier. Självreplikera vid celldelning och gemensama gener t.ex. anti-biotikaresistens som bakterierna kan dela med sig kraftfullt verktyg som vi har lyckats att kapa

Hur kan vi använda oss av det här?

Applications

• Biomedicinska lösningar, t.ex. vaccin Hepatit-B
  • Framställer ett ytprotein på bakterien, istället för att injecra ett helt virus, det räcker med själva proteinet för att starta immunförsvaret istället för en riktig virus
  • Produktion av insulin
    • jästceller istället för bakterier
    • post-transationella modifieringar
    • de är eukaryota celler, så det krävs för insulin
  • Koaguleringsfaktor-8

GMO

• Använder man av rekombinant DNA-teknik för att skapa,
• t.ex. resistens mot en herbicid Genterapi
• CRISPR/Cas9 framställer man på det sättet
• Kan ersätta delar av vårat DNA
• behöver en vektor, för att transportera in
  • Adeno-virus är en vanlig vektor, som man producera rekombinant Genanalys
• polymeraser, Polymerace-Chain-Reaction.
  • en teknik för att detektera närvaron av ett viss protein
  • de kan kopiera en molekyl många gånger
  • specifika temperaturer med hjälp av rekombinant

Verktyg som behövs

• "saxar", som kan bryta ner
• "capping site" en plats i plasmiden där själva urklippandet kan ske
  • en sekvens med baspar som enzymet känner igen
• "limmet", dna-ligaser så det går att foga fast
• värd-cell, ofta bakterieceller
• rätt miljö, LP-medium ett slags näringsmedel som bakterier trivs i
  • ska göra massa olika kopier, ofta proteiner av det

Vektorer

Själva plasmiden, en slags molekyl som kan transportera DNA som vi är intresserad av

En viktig del är

• Ori - origin of replication
• massa olika baspar, som olika restriktionsmolekyler kan känna igen
• AmpR: kan producera β-laktamas, den förhindra verkan av ampicilin
• Promotor krävs för att pol ska kunna binda och uttrycka en gen
• LacZ alpha: poängen
  • när vi inte fogat in våran gen är LacZ kontakt
  • om vi för in den, bryter vi upp LacZ, för det vi klipper är i mitten av det
  • om man inte fört in kommer LacZ kommer binda till alpha-peptiden i β-kalaktas
  • Muterad E Coli-stammen så den har inte i sitt vanliga DNA den här alpha-peptiden, bara delta-delen,
    • för att e coli ska kunna producera en b-kalaktas
• IPTG inaktivar repressor genet
  • om vi tillsätter IPTG så kommer det vara fritt fram att uttrycka alpha-

Restriktionenzymer

• BamH I
  • GGATC
  • Generera strick enzo
  • klipper snett för att det är lättare att sammanfoga sen

Värd-cell: E. Coli

Vanligt modellorganism Gram negativ

• den färgas rosa (positiva lila) med graminfärgning
• de har tunt membranvägg
• grovt dela upp bakterierar i de som har/inte har de yttre höljet Finns naturligt i tjocktermen

Insulin

Började produceras 1920-talet Krävdes upp till 70 grisar för att hålla en person levande i ett år utan rekombinant DNA-teknik Utvann från bukspottskörteln, 1g på 70 grisar 1970 utvecklades rekombinant DNA-teknik, kommerciellerades på 1980-talet

Labsyfte

Ska avgöra om våran gen av intresse har lyckats klona in i vektorn Fokus är inte gen, mer på själva processen t.ex. insulin

Transformation

Vi kommer använda oss av rekombinanta plasmider och kombinera de med e coli-celler Cellerna måste vara mottagliga för att ta upp plasmiden Calciumjoner neutraliserar den negativa ytan (fosfoliper och glykoliper), så att DNA kan närma sig ytan det är också negativt Sen höjer man med en värmsjuk, membranet blir permeabiliserat.

blue-white screening lacz kommer naturligt med e coli, mutantsträng som saknar alphadelen.

En analog till en galaktosias, den heter X-gal, när den bryts ner bildas galaktos, men den bildar också 4-chloro-3-bromo-indigo som gör att det blir blå, då kan vi se vilka bakteriera som har en intakt lacZ eller inte.

De som har våran gen av intresse blir inte färgade, de är svåra att se, men inte osynliga.

Western Blot kan man använda för att identifiera ett protein av intresse