# Att utforska proteiner  
**Sahlgrenska Akademin – LPG001 Biokemi – 2025-11-17**  
**Linda Johansson, Ph.D. – linda.johansson.4@gu.se**

---

## Innehåll
- Begreppet ”proteom”
- Skillnader i proteiners kemiska och fysikaliska egenskaper och hur dessa ligger till grund för olika reningsprinciper:  
  - gelfiltrering  
  - jonbyteskromatografi  
  - affinitetskromatografi
- Principer och tillämpning av elektrofores (SDS-PAGE)
- Översiktlig beskrivning av proteinanalys med immunologiska tekniker och ”blottning”  
  - antikroppar och antigen  
  - skillnad mellan monoklonala och polyklonala antikroppar  
  - principen för ELISA  
  - kliniska exempel
- Masspektrometri – introduktion
- Förutsättningar för proteinstrukturbestämning med:  
  - röntgenkristallografi  
  - NMR  
  - kryo-EM  
  och deras medicinska applikationer

---

## Varför studera proteiner?
- Forskning:
  - strukturbiologi – hur proteiner ser ut  
  - biokemi – vad de binder  
  - var de finns i kroppen  
  - hur de påverkar sjukdomar
- Klinik:
  - HIV-test (antikroppar, ELISA)
  - COVID-19 (antigen, antikropp, ELISA)
  - Myelom (detektion av IgM med proteinelektrofores)

---

## Proteiner
- Proteiner utför viktiga funktioner i de flesta biologiska processer, t.ex. DNA-replikation och signalöverföring.
- Sensoriska funktioner som smak, lukt, temperatur och beröring bygger på proteiner.
- Aminosyrasekvensen bestämmer konformationen (3D-strukturen) och därmed funktionen.

---

## Proteiner – 2024 års Nobelpris
- Handlar om proteiners strukturer och hur de kan designas och förutsägas.  
- David Baker: byggt helt nya proteiner.  
- Demis Hassabis & John Jumper: AI-modellen AlphaFold som löser strukturföre­spådningsproblemet.

---

## Genom vs proteom
- **Genom:** komplett DNA-sekvens (~3 miljarder baser, ca 23 000 gener).  
- **Proteom:** de proteiner som uttrycks av en cell vid en given tidpunkt.  
- Proteomet påverkas av:
  - celltyp
  - tidpunkt
  - proteininteraktioner
  - posttranslationella modifieringar  
- Proteomet är mycket dynamiskt och komplext.

---

## Hur kan vi studera proteiner?
- Vi behöver rena fram ett specifikt protein ur cellens innehåll.  
- Proteiner skiljer sig i:
  - storlek  
  - laddning  
  - löslighet  
  - bindningsaffinitet  
- Egenskaperna används i reningsmetoder.

---

## Preparation av protein – homogenisat
- Celler bryts upp → homogenisat.  
- Centrifugering separerar komponenter:
  - **pellet:** i botten  
  - **supernatant:** ovanför

---

## Kromatografi – princip
- Små kulor/beads med definierade egenskaper packas i en kolonn (fast fas).  
- Buffert + prov rör sig genom kolonnen (mobil fas).  
- Olika typer används beroende på proteinets egenskaper.

---

## Gelfiltrering – separation efter storlek
- Porösa kulor släpper in små molekyler men inte stora.  
- **Stora proteiner kommer ut först.**

---

## Jonbyteskromatografi – separation efter laddning
- Proteinets totala laddning styr bindning.
- **Anjonbytare:** binder negativa grupper.  
- **Katjonbytare:** binder positiva grupper.  
- Eluering sker med pH-ändring eller saltgradient.

---

## Affinitetskromatografi – separation efter selektivitet
- Specifik bindning mellan protein och ligand.  
- Exempel: 6×His-tag → stark bindning till Ni²⁺-kolonn.  
- Eluering ofta med imidazol.

---

## Analys av proteinrening
- Flera reningssteg kombineras.  
- Man följer renheten vid varje steg.  
- Val av metod beror på:
  - önskad renhet  
  - proteinets egenskaper

---

## Gelelektrofores – princip
- Molekyler med nettoladdning vandrar i elektriskt fält.  
- Polyakrylamidgel separerar efter storlek.  
- Små proteiner rör sig snabbare.

---

## SDS-PAGE
- SDS ger uniform negativ laddning proportionell mot massa.  
- Separation sker enbart på **storlek**.  
- Efter körning färgas gelen (Coomassie blue).

---

## SDS-PAGE i reningskontroll
- Prover tas efter varje reningssteg.  
- Rätt band ska bli tydligare och renare för varje steg.

---

## Gelfiltrering vs SDS-PAGE
- **Gelfiltrering:** störst först, används för rening.  
- **SDS-PAGE:** minst först, används för analys.

---

## Antikroppar och antigen
- Antikroppar → proteiner som känner igen antigen.  
- Del av antigenet som känns igen = **epitop**.

---

## Monoklonala vs polyklonala antikroppar
- **Monoklonala:** känner igen exakt samma epitop.  
- **Polyklonala:** mix som känner igen flera epitoper på samma antigen.

---

## ELISA – princip
- Enzymbundet antikroppssystem som ger färg vid substrattillsats.  
- Två huvudtyper:
  - **Indirekt ELISA:** detekterar antikroppar (t.ex. HIV)  
  - **Sandwich ELISA:** detekterar antigen (t.ex. COVID-19)

---

## Western Blot
- SDS-PAGE → proteiner förs över till membran.  
- Inkuberas med primär + sekundär antikropp.  
- Signal mäts via enzym eller fluorescens.

---

## Masspektrometri – princip
- Identifierar peptider/proteiner.  
- Möjliggör analys av posttranslationella modifieringar.  
- Peptider joniseras → accelereras → separeras efter massa (t.ex. MALDI-TOF).

---

## Masspektrometri – användning
- Identifiera proteiner  
- Verifiera rening  
- Kartlägga PTM  
- Analysera sekvens och evolutionärt ursprung  

---

## Proteiners 3D-struktur
- Bestäms av aminosyrasekvens.  
- Experimentella metoder krävs ofta trots AI-prediktioner som AlphaFold.  
- Struktur är centralt för läkemedelsutveckling.

---

## NMR
- Baserad på magnetiska atomkärnor.  
- Resonans påverkas av atomernas omgivning.  
- Typer:
  - 1D NMR – veckningsinformation  
  - NOESY – avstånd mellan protoner (<5 Å)  
- Begränsning: protein <50 kDa  
- Resultat: ensemble av möjliga strukturer.

---

## Röntgenkristallografi
- Proteinet kristalliseras.  
- Kristall bestrålas med röntgen → diffraktionsmönster samlas.  
- Matematiskt → elektrondensitetskarta → modell av struktur.  
- Hög upplösning ger mer detaljer.

---

## Kryo-EM
- Direkt visualisering av frys-införda molekyler.  
- Kräver inga kristaller eller isotoper.  
- Single-particle-analys möjlig.  
- Snabb metodutveckling → dominerande teknik idag.  
- Upplösning beror på proteinets storlek.  
- Nobelpris 2017.

---

## Kryo-EM – procedur
- Protein fryses på grid i flytande helium.  
- Exponeras för elektronstråle i vakuum.  
- Många 2D-bilder sammanställs → 3D-struktur.