vault backup: 2025-12-08 19:58:36

content/Biokemi/Plasmidlabb/Anteckningar I.md

@@ -1,126 +0,0 @@
----
-föreläsare: Oliver Forsell
-tags:
-  - biokemi
-  - anteckningar
-  - rekombinant-dna-teknik
----
-Rekombinant DNA-teknik
-
-Steg
-- Molekylär kloning
-	- använder sig av en DNA snutt, en reflektionsenzym
-	- foga in det i en slags vektor, ofta i en plasmid
-	- Samma plasmid har förmåga klippa iihop samma baspar
-	- foga ihop sin DNA
-		- med hjälp av vegasenzym
-- Transformationen
-	- För in den här vektor i en värd-cell
-- Selektera och replikera
-	- Växa den i fermentortankar, så man får tillräckligt mycket av sitt material
-
-#### Plasmider
-
-Dubbelsträngat ciruklärt DNA, finns i de flesta bakterier.
-Självreplikera vid celldelning och gemensama gener
-t.ex. anti-biotikaresistens som bakterierna kan dela med sig
-kraftfullt verktyg som vi har lyckats att kapa
-
-Hur kan vi använda oss av det här?
-
-### Applications
-
-- Biomedicinska lösningar, t.ex. vaccin Hepatit-B 
-	- Framställer ett ytprotein på bakterien, istället för att injecra ett helt virus, det räcker med själva proteinet för att starta immunförsvaret istället för en riktig virus
-	- Produktion av insulin
-		- jästceller istället för bakterier
-		- post-transationella modifieringar
-		- de är eukaryota celler, så det krävs för insulin
-	- Koaguleringsfaktor-8
-
-GMO
-- Använder man av rekombinant DNA-teknik för att skapa, 
-- t.ex. resistens mot en herbicid
-Genterapi
-- CRISPR/Cas9 framställer man på det sättet
-- Kan ersätta delar av vårat DNA
-- behöver en vektor, för att transportera in
-	- Adeno-virus är en vanlig vektor, som man producera rekombinant
-Genanalys
-- polymeraser, Polymerace-Chain-Reaction. 
-	- en teknik för att detektera närvaron av ett viss protein
-	- de kan kopiera en molekyl många gånger
-	- specifika temperaturer med hjälp av rekombinant
-
-
-### Verktyg som behövs
-- "saxar", som kan bryta ner
-- "capping site" en plats i plasmiden där själva urklippandet kan ske
-	- en sekvens med baspar som enzymet känner igen
-- "limmet", dna-ligaser så det går att foga fast
-- värd-cell, ofta bakterieceller
-- rätt miljö, LP-medium ett slags näringsmedel som bakterier trivs i
-	- ska göra massa olika kopier, ofta proteiner av det
-
-### Vektorer
-Själva plasmiden, en slags molekyl som kan transportera DNA som vi är intresserad av
-
-En viktig del är 
-- Ori - origin of replication
-- massa olika baspar, som olika restriktionsmolekyler kan känna igen
-- AmpR: kan producera β-laktamas, den förhindra verkan av ampicilin
-- Promotor krävs för att pol ska kunna binda och uttrycka en gen
-- LacZ alpha: poängen 
-	- när vi inte fogat in våran gen är LacZ kontakt
-	- om vi för in den, bryter vi upp LacZ, för det vi klipper är i mitten av det
-	- om man inte fört in kommer LacZ kommer binda till alpha-peptiden i β-kalaktas
-	- Muterad E Coli-stammen så den har inte i sitt vanliga DNA den här alpha-peptiden, bara delta-delen,
-		- för att e coli ska kunna producera en b-kalaktas
-- IPTG inaktivar repressor genet
-	- om vi tillsätter IPTG så kommer det vara fritt fram att uttrycka alpha-
-
-### Restriktionenzymer
-- BamH I
-	- GGATC
-	- Generera strick enzo
-	- klipper snett för att det är lättare att sammanfoga sen
-
-### Värd-cell: E. Coli
-Vanligt modellorganism
-Gram negativ
-- den färgas rosa (positiva lila) med graminfärgning
-- de har tunt membranvägg
-- grovt dela upp bakterierar i de som har/inte har de yttre höljet
-Finns naturligt i tjocktermen
-
-
-### Insulin
-Började produceras 1920-talet
-Krävdes upp till 70 grisar för att hålla en person levande i ett år utan rekombinant DNA-teknik
-Utvann från bukspottskörteln, 1g på 70 grisar
-1970 utvecklades rekombinant DNA-teknik, kommerciellerades på 1980-talet
-
-### Labsyfte
-Ska avgöra om våran gen av intresse har lyckats klona in i vektorn
-Fokus är inte gen, mer på själva processen
-t.ex. insulin
-
-## Transformation
-
-Vi kommer använda oss av rekombinanta plasmider och kombinera de med e coli-celler
-Cellerna måste vara mottagliga för att ta upp plasmiden
-Calciumjoner neutraliserar den negativa ytan (fosfoliper och glykoliper), så att DNA kan närma sig ytan det är också negativt
-Sen höjer man med en värmsjuk, membranet blir permeabiliserat.
-
-blue-white screening
-lacz kommer naturligt med e coli, mutantsträng som saknar alphadelen.
-
-En analog till en galaktosias, den heter X-gal, när den bryts ner bildas galaktos, men den bildar också 4-chloro-3-bromo-indigo som gör att det blir blå, då kan vi se vilka bakteriera som har en intakt lacZ eller inte.
-
-De som har våran gen av intresse blir inte färgade, de är svåra att se, men inte osynliga.
-
-Western Blot kan man använda för att identifiera ett protein av intresse
-
-
-
-

content/Biokemi/Plasmidlabb/Anteckningar II.md

@@ -1,89 +0,0 @@
----
-tags:
-  - biokemi
-  - rekombinant-dna-teknik
-  - anteckningar
-föreläsare: Oliver Forsell
-date: 2025-11-26
----
-Sätter dit en prime av intresse, restriktionssite. En insert som med hjälp av restriktionsenzym kan kapa och får en sticky ends.
-
-self-ligated vector, plasmiden binder till sig själv, isolera med blue/white.
-
-ampicillin?
-x-gal?
-iptg? lacz-alpha restriction, sitter ett repressionprotein, iptg inaktiverar en repressor
-AmpR: ampicillin restistans
-pellet?
-supernatant: det som hamnar ovanpå
-nukleasfritt vatten
-kilator? ko-faktor för vatten
-RnasaA: bryter ner RNA
-SDS löser upp fosfolipider och proteiner i cellmembranet
-eulera
-SYBR safe
-
-
-
----
-
-Dagens labb
-
-# Rena fram plasmiden
-
-# Klippar ur genen av intresse
-
-# Kör agarose gel
-
-# Tolka resultatet
-
-
-
-----
-
-### What are the sites the plasmid contains that allow for this experiment? 
-- Lacz
-- Β-lactamas (ampicilin resistansen)
-- BamH-insertion site, i vårta multiple cloning site
-- Origin of replication för att kunna replikera
-
-#### What are the 3 compounds in the LB plates that allow for selection of bacteria with plasmid and the distinction of plasmids with and without the inserted gene?
-- IPTG
-- X-Gal
-- Ampicillin
-
-### What are the six steps in plasmid preparation and purification? 
-1. Pelleteringen
-2. **Suspendera**, lösa upp pelleten
-3. **Lysering** - så det läcker ut plasmid
-4. **Neutralisera** - skyddar plasmiden på nytt
-5. **Skölja bort salter**
-6. Tillsätta vatten för att eulera ut vår plasmid
-
-
-### What is a restriction enzyme and why was it used in this experiment? 
-
-Hjälpa till att klippa ut genen och foga in vår plasmid, sticky ends
-
-
-### Explain the principle of Gel Electrophoresis, what is it for? 
-
-Separation av storlek eller massa på våra DNA-fragment. Elektrostatiskt repulsion, som får våra joner att separeras
-
-### What´s the compound that allows for the visualization of the DNA in the gel?
-
-SYBR safe
-
-### How many times does BamHI cut the plasmid without the insert? And the plasmid with the insert? 
-
-Hur många gånger kommer BamHI klippa vår plasmed
-- utan insert: 1  
-- med insert: 2 på var sin sida om inserten för att få ut den
-
-### Explain the different plasmid conformations that exist.
-
-- relaxed
-- supercoiled supper snabbt, de är tvinnade
-- linjära
--
-

content/Biokemi/Plasmidlabb/Förståelse.md

@@ -1,89 +0,0 @@
-Vektorer är DNA-molekyler (t.ex. plasmider) som har specifika klipp- och infogningsställen där man kan sätta in gener för kloning eller uttryck.
-
-När man klipper DNA använder man restriktionsenzymer, som känner igen och klyver specifika sekvenser.
-
-MCS (multiple cloning site) är en kort DNA-region i en vektor som innehåller många unika restriktionsställen där man kan klippa och sätta in gener.
-
-Man ligerar DNA med DNA-ligas, ett enzym som kopplar ihop ändarna genom att skapa fosfodiesterbindningar.
-
-BamH I är ett restriktionsenzym
-
-Klyvning kan ge två typer av ändar: sticky ends (överhängande ändar) och blunt ends (trubbiga ändar).
-
-E. coli används eftersom den växer snabbt, är lätt att odla och genetiskt manipulera, och vi känner dess genom mycket väl.
-
-### Dag 1 & 2:
-- Genen lacZ i E. coli kodar för enzymet β-galaktosidas
-- IPTG är en inducer som behövs för att slå på lacZ, så att enzymet faktiskt bildas
-- X-gal är ett konstgjort substrat, som blir blått när de klyvs av β-galaktosidas
-- X-gal och 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-Galactopyranoside är samma sak
-- Normalt klyver enzymet β-galaktosidas X-gal → blått färgämne bildas
-- För att substratet ska bli blått krävs lacZ, IPTG och X-gal. Saknas några av dem blir det inte blått
-- Ampicillin dödar bakterier som inte har plasmiden, så bara de vi vill studera överlever.
-- Heat-shock 0->37 grader skapar en tryckskillnad och öppnar porer i membrandet så plasmid-DNA kan ta sig in i cytoplasman
-	- Nerkylning direkt efteråt gör att de stannar kvar
-- LB-plattan är både odlingsmedium och selektions-/screeningsverktyg
-	- näring (aminosyror, mineral, salt, tillväxtfaktorer osv)
-	- ampicillin dödar allt utan plasmid
-	- IPTG slår på lacZ
-	- X-gal infärgning
-
-### Dag 3
-
-#### A. Förbered plasmiden
-
-Cellerna centrifugeras, spräcks och plasmiden separeras från cellskräpet. Plasmiden fångas sedan upp i en spin-kolonn, tvättas ren och sköljs ut i en ny tub.
-
-![[Pasted image 20251128104012.png]]
-
-Vi har två lösningar i separata falkonrör, en blå (utan våran insert) och en vit (med vår insert). Upprepa alla stegen för varje lösning.
-
-| Steg            | Input                | Output                                 | Kort beskrivning                                                |
-| --------------- | -------------------- | -------------------------------------- | --------------------------------------------------------------- |
-| 1. Pelletera    | Bakteriekultur       | Cellpellet + borttagen supernatant     | Celler centrifugeras ned till botten.                           |
-| 2. Lös upp      | Cellpellet + A1      | Jämn cellsuspension                    | Löser upp pelleten så lysering kan fungera.                     |
-| 3. Lysera       | Cellsuspension + A2  | Lyserad lösning                        | Cellmembran öppnas, plasmid + DNA/proteiner frigörs.            |
-| 4. Neutralisera | Lyserad lösning + A3 | Fällt skräp + plasmid i lösn.          | Stora DNA/proteiner klumpar ihop sig. Plasmiden stannar löslig. |
-| 5. Centrifugera | Neutraliserad mix    | Pellet (skräp) + supernatant (plasmid) | Plasmiden separeras från cellskräp.                             |
-| 6. Ladda kolumn | Supernatant          | Plasmid bundet till kolumn             | Plasmiden fastnar på membranet; skräp rinner igenom.            |
-| 7. Tvätta       | Kolumn + A4          | Renad kolumn                           | Tar bort salter, proteiner och kvarvarande föroreningar.        |
-| 8. Torka kolumn | Tvättad kolumn       | Torr kolumn                            | Extra spinn för att avlägsna etanolrester.                      |
-| 9. Skölj        | Kolumn + vatten      | Ren plasmid-DNA i eppendorf            | Vattnet löser av plasmiden från membranet.                      |
-Vi får nu ut en ren plasmid
-
-#### B. klyv plasmiden med BamHI och jämför den med en oklippt kontroll.
-
-Skapa en BamHI-enzym som kan klippa plasmiden, klipp plasmiden och tillsätt färgnings
-
-Master solution:
-- vatten, buffert och enzym blandas in
-
-Digested = cut = plasmid som har blivit klippt vid BamHI-sajten
-Cybr safe gör det synligt i UV-ljus utan att vara cancerframkallande
-loading dye gör att vi kan se vad vi pipeterar in i elektroforesen i nästa steg
-
-![[Pasted image 20251128104645.png]]
-
-
-| Steg                          | Input                     | Output                           | Kort beskrivning                                     |
-| ----------------------------- | ------------------------- | -------------------------------- | ---------------------------------------------------- |
-| 1. Gör BamHI-mastermix        | H₂O + 10× buffer + BamHI  | Färdig enzymmix                  | Blandar så alla prover får samma enzym och buffer.   |
-| 2. Fördela plasmider          | Plasmid-DNA               | Tub “white-cut” + tub “blue-cut” | Flyttar plasmiderna till nya rör för klippning.      |
-| 3. Tillsätt master + inkubera | Plasmid + BamHI-mastermix | Digesterat (klippt) DNA          | Enzymet klipper plasmiden vid BamHI-sajten.          |
-| 4. Tillsätt loading dye       | Klippt DNA + dye          | Färdiga “cut”-prover för gel     | Gör proverna tyngre och synliga i gelen.             |
-| 5. Gör oklippta kontroller    | Plasmid + loading dye     | “white-uncut” + “blue-uncut”     | Referensprover som visar hur odigesterat DNA ser ut. |
-
-Du blandar en BamHI-lösning, blandar den med plasmiderna och låter enzymet klippa DNA:t vid 37 °C. Sedan tillsätter du loading dye och gör även två oklippta kontroller för jämförelse i gelen.
-
-
-#### Steg 3
-
-Elektrofoera och läs av i UV-ljus
-
-![[Pasted image 20251128104949.png]]
-
-| Steg                         | Input                       | Output                           | Kort beskrivning                              |
-| ---------------------------- | --------------------------- | -------------------------------- | --------------------------------------------- |
-| 7. Ladda prover              | Marker + cut/uncut-prover   | Gel med laddade prover           | Proverna placeras i rätt ordning i brunnarna. |
-| 8. Kör elektrofores          | Gel i tank + 120 V          | Separering av DNA-fragment       | DNA vandrar efter storlek genom gelen.        |
-| 9. Fotografera               | Färdigkörd gel              | UV-bild med DNA-band             | Bandmönstret visar plasmidens storlek/insätt. |

content/Biokemi/Plasmidlabb/Instuderingsfrågor.md

@@ -1,24 +0,0 @@
----
-tags:
-  - biokemi
-  - instuderingsuppgifter
-  - plasmid
----
-#### Name three applications of molecular cloning. 
-#### What is a plasmid? 
-#### Name the three main steps involved in recombinant DNA technology? 
-#### What is a restriction enzyme? 
-#### What are the bacteria used in your protocol? 
-#### Explain the calcium/phosphate (heat-shock) method and what it is used for. 
-#### How can we selectively grow bacteria that have taken up the plasmid? 
-#### Explain the principle behind blue and white screening and its purpose in this lab.
-
-#### What are the sites the plasmid contains that allow for this experiment? 
-#### What are the 3 compounds in the LB plates that allow for selection of bacteria with plasmid and the distinction of plasmids with and without the inserted gene?
-#### What are the six steps in plasmid preparation and purification?
-#### What is a restriction enzyme and why was it used in this experiment? 
-#### Explain the principle of Gel Electrophoresis, what is it for? 
-#### What´s the compound that allows for the visualization of the DNA in the gel? 
-#### How many times does BamHI cut the plasmid without the insert? 
-#### And the plasmid with the insert? 
-#### Explain the different plasmid conformations that exist. Förståelse Biokemi / Plasmidlabb / 

content/Biokemi/Plasmidlabb/Rapport.md

@@ -1,38 +0,0 @@
-
-## Att göra
-- [ ] Samla ihop, infoga bilder
-- [ ] Skapa ordentliga referenser
-- [ ] Annotera resultat med korrekt storlek (rader) och namn på kolumner
-- [ ] Diskution: Svara på Olivers fråga angående vad som kan göras för att förbättra sannolikheten för att inte få in _vita_ ämnen i _blåa_ provet  
-- [ ] Se till att komprimera texten, så allt viktigt får plats på 3 sidor
-## Referenser
-
-- A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.
-	- H.C. Birnboim, J. Doly
-	- 1973
-	- [10.1093/nar/7.6.1513](https://doi.org/10.1093/nar/7.6.1513)
-- Nonchromosomal Antibiotic Resistance in Bacteria: Genetic Transformation of _Escherichia coli_ by R-Factor DNA
-	- Stanley N. Cohen, Annie C. Y. Chang, and Leslie Hsu
-	- 1972
-	- 10.1073/pnas.69.8.2110
-- New versatile cloning and sequencing vectors based on bacteriophage M13
-	- M P Kieny, R Lathe, J P Lecocq
-	- 1983
-	- 10.1016/0378-1119(83)90039-2
-- Restriction and modification enzymes and their recognition sequences
-	- R J Roberts
-	- 1985
-	- 10.1093/nar/13.suppl.r165
-- Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose--ethidium bromide electrophoresis
-	- P A Sharp, B Sugden, J Sambrook
-	- 1973
-	- 10.1021/bi00740a018
----
-**Jackson, Symons & Berg (1972)**
-
-_Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40: Circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli._
-PNAS 1972.
-PMCID: PMC389671
-PMID: 4342968
-
-→ Nobelpriset 1980 till Paul Berg

content/Biokemi/Plasmidlabb/Slides II.md

@@ -1,187 +0,0 @@
-Recombinant DNA technology
-Lecture by:
-Anne Wöhr
-anne.wohr@gu.se
-
-Molecular Cloning
-→ Performed beforehand (not done during this lab)
-
-Molecular Cloning
-→ Performed beforehand (not done during this lab)
-We aim to isolate/separate 
-these two plasmids to 
-select the recombinant 
-plasmid and to verify the 
-presence of the gene of 
-interest
-
-Day 1: Transformation of competent cells
-→ performed during this lab (day 1)
-
-Day 1: Selection of transformed cells
-→ performed during this lab (day 1 + day 2)
-
-Day 2: Picking & expansion of blue
-and white colonies
-→ performed during this lab (day 2)
-
-Revision 
-Blue-white screening
-Plasmid:
-• AmpR: Ampicillin resistance (β-lactamase)
-• LacZ: α-peptide for functional β-galactosidase 
-enzyme
-• BamHI restriction site in LacZ gene for 
-insertion of DNA
-Growth medium:
-• Ampicillin: Only successfully transformed 
-bacteria carrying plasmids can survive in the 
-presence of ampicillin
-• IPTG : activates transcription of the LacZ gene 
-by binding its repressor
-• X-gal: β-galactosidase degrades X-gal. The 
-product has a blue colour!
-
-Day 3 - work overview
-✓ Purify plasmids 
-✓ Restriction enzyme digestion
-✓ Run on agarose gel
-✓ Interpret results
-
-Day 3: Material
-Spin column
-Tubes labeled with
-A1; A2; A3; A4; H2O
-Plasmid preparation kit
-Collection tube & 
-spin column (blue)
-
-Day 3: Plasmid purification
-→ performed during this lab (day 3)
-Buffer A1 (Cell Suspension)
-Tris/HCl (pH 8.0), EDTA, RNase A
-Buffer A2 (Cell Lysis)
-NaOH; SDS
-Buffer A3 (Neutralization/Binding)
-Contains acetate and guanidine 
-hydrochloride
-Buffer A4 (Wash, reconstituted)
-Contains ethanol, NaCl, EDTA, and 
-Tris/HCl
-
-cells grown in LB-
-media overnight
-Transfer 2x 750 µl into 
-microcentrifuge tube 
-Bacterial pellet = cells + plasmid
-→ Discard superatant
-Balance the centrifuge
-Day 3: harvest cells & purify plasmids
-A1 - resuspension buffer
-A2 – cell lysis buffer
-A3 – neutralization/ 
-binding buffer
-Plasmid in supernatant
-cell debris as pellet
-transfer supernatant
-to column
-Plasmid binding
-Discard 
-flow-through
-Wash with A4
-Transfer column to new tube
-add H2O to elute plasmid
-
-QIAprep Miniprep Handbook, Appendix A: Background Information, Preparation of cell lysates, p 43 
-Plasmid purification
-Buffer A1: 
-Bacterial cells are resuspended in a buffer containing Rnase A.
-Buffer A2: 
-Bacteria are lysed under alkaline conditions (NaOH). SDS solubilizes the phospholipid 
-and protein components of the cell membrane
-Lysis and release of cells contents. Alkaline conditions: denaturation of chromosomal 
-and plasmid DNA as well as proteins.
-Buffer A3: 
-The lysate is neutralized and adjusted to high-salt-binding conditions. The high salt 
-concentration causes denatured proteins, chromosomal DNA, cellular debris, and SDS 
-to precipitate, while the smaller plasmid DNA renatures correctly and stays in solution. 
-DNA is bound to silica membrane of spin columns in high-salt buffer. RNA, cellular 
-proteins and metabolites are not retained on the membrane.
-Buffer A4: 
-Washing and reconstitution of DNA. Salts are efficiently removed by this wash step.
-H2O: 
-The purified plasmid DNA is eluted from silica membrane by addition of water. The 
-elution is pe is dependent on a low salt concentration and a stable pH (pH 7-8.5).
-
-Restriction enzyme working solution:
-Restriction enzyme buffer
-H2O
-Restriction enzyme (keep it cold!)
-Add restriction enzyme to a portion of eluted plasmid
-KEEP THE REST OF UNDIGESTED PLASMID AS CONTROLS FOR 
-LATER USE Incubate at 37°C for 60 min 
-Day 3: Restriction enzyme digestion
-
-Day 3: Restriction enzyme digestion
-Plasmid without insert (2700 bp)
-Plasmid with insert in BamHI site (4200 bp)
-Cut with BamHI → bands at 2700 bp and 1500 bp
-
-• Samples are mixed with 6x loading
-dye to make them ”heavier” to stay
-in wells
-• Separation of DNA molecules
-based on their size 
-• DNA negatively charged
-• Agarose gel for separation
-• Shorter molecules move faster and 
-migrate farther than longer ones
-• Visualization of DNA with SYBR 
-safe DNA stain
-Day 3: Agarose Gel Electrophoresis
-
-GeneRuler 1kb DNA ladder = size marker
-marker
-2700 bp
-1500 bp
-4200 bp
-Day 3: Expected Results
-
-• Relaxed/linear: intact circle but “nick” in one strand
-• Linear: both strands are cut (at the same location)
-• Supercoiled: fully intact with both strands uncut, appears in a compact 
-form
-Plasmid conformation affects migration
-
-Lab schedule
-✓ Purify plasmids 
-✓ Restriction enzyme digestion
-1-2h incubation time → lunchbreak and 
-everyone will be back at the same time
-✓ Run on agarose gel
-approximately 1h → go through the
-expected results to be able to ask
-appropriate questions
-✓ Interpret results
-make sure to ask a lot of questions while you have
-the chance!!!
-
-Lab reports
-✓ Write according to the guidelines on the handout on Canvas
-✓ One lab report per group (Names and group number on the cover page)
-✓ In English
-✓ Upload your lab reports on CANVAS, deadline 07/12/2025
-
-Lecture Questions
-1. What are the sites the plasmid contains that allow for this experiment?
-2. What are the 3 compounds in the LB plates that allow for selection of
-bacteria with plasmid and the distinction of plasmids with and without
-the inserted gene?
-3. What are the six steps in plasmid preparation and purification?
-4. What is a restriction enzyme and why was it used in this experiment?
-5. Explain the principle of Gel Electrophoresis, what is it for?
-6. What´s the compound that allows for the visualization of the DNA in
-the gel?
-7. How many times does BamHI cut the plasmid without the insert? And
-the plasmid with the insert?
-8. Explain the different plasmid conformations that exist.

content/Biokemi/Plasmidlabb/Slides.md

@@ -1,219 +0,0 @@
-Recombinant DNA technology
-Lecture by:
-Anne Wöhr
-anne.wohr@gu.se
-
-Recombinant DNA technology
-Molecular cloning Transformation Selection and 
-Replication
-Performed during this lab
-
-Plasmids
-• Commonly found in bacteria as extra-chromosomal 
-circular dsDNA molecules 
-• Able to self-replicate during cell division
-• Often carry beneficial genes like antibiotic resistance
-• Bacteria can share genetic information through 
-plasmid transfer
-By: Maya Kostman
-How could this be useful for us?
-
-Applications of recombinant DNA 
-technologies
-Khan S., 2016
-Biopharmaceuticals:
-Vaccines eg hepatitis B vaccine
-recombinant proteins eg Insulin (Diabetes), Factor VIII (hemophilia)
-Genetically modified organisms: 
-Organisms that have been genetically modified to exhibit specific traits eg 
-herbicide-resistant crop plants
-Gene Therapy: 
-In some genetic disorders, patients lack the functional form of a gene. Gene 
-therapy attempts to provide a normal copy of the gene to the cells of the 
-patient.
-Gene Analysis: 
-build artificial, recombinant versions of genes that help understand how 
-genes in an organism function
-
-• Scissors: DNA restriction enzymes (DNA digestion)
-• Cutting sites: multiple cloning sites (MCS)
-• Glue: DNA ligase (DNA ligation)
-• Host: bacterial cells (Transformation)
-• Environment: LB medium or LB agar plates (Culturing)
-• Goal: making more identical copies, or expression (making proteins)
-Toolbox for molecular cloning
-
-✓ DNA molecule that acts as a vehicle to carry foreign genetic materials 
-into another cell, where it can be replicated or expressed.
-Vectors
-Ori (origin of replication): 
-Replication is initiated here, enabling the plasmid to reproduce itself.
-MCS (multiple cloning site):
-Short segment of DNA which contains many restriction sites. This
-allows a piece of DNA to be inserted into that region. The used
-plasmid contains a BamHI cleavage site in its MCS.
-AmpR gene: 
-encodes the enzyme beta-Lactamase, which inactivates ampicillin.
-Cells containing a plasmid vector which expresses AmpR can be
-selected from those that do not by growth in an ampicillin-containing
-medium.
-Lac promoter: 
-binding site of RNA polymerase to initiate expression. IPTG binds
-and inactivates the LacI repressor protein and thereby enables
-expression of genes downstream of the promoter.
-LacZ⍺ gene: 
-encodes the alpha-peptide of the enzyme beta-galactosidase.
-Functional beta-galactosidase consits of the alpha- and omega-
-peptide. The used E-coli strain carries the lacZ deletion mutant
-which contains the omega-peptide but lacks the alpha-peptide. The
-activity of mutant beta-galactosidase is rescued by the presence of
-the alpha-peptide present in the plasmid (alpha-complementation).
-
-Restriction enzymes (Scissors)
-✓ Sequence-specific DNA endonucleases
-✓ Recognise and cleave DNA sequences at specific restriction sites
-✓ Generate “sticky end” or “blunt end”
-
-Escherichia coli (Host)
-✓ Model organism in molecular biology
-✓ Gram negative, rod shaped bacteria
-✓ Located in lower intestine
-
-The History of Insulin Production
-1921: Discovery of insulin
-1922: Leonard Thompson became the first person with diabetes ever 
-treated through administration of insulin
-1923: Insulin is commercialized
-Insulin sales kit, Eli Lilly and Company, 1940s
-14 cows or 70 pigs to sustain a diabetic 
-patient for 1 year
-1970: Recombinant DNA technology is 
-developed
-1982: Recombinant insulin is commercialized 
-
-Production of Insulin
-Adapted from “From DNA to Beer: Harnessing Nature in Medicine & Industry”
-
-Purpose of this lab: 
-Determine whether a gene of interest has 
-been successfully cloned into a vector.
-
-Transformation
-
-Transformation
-During the incubation 
-on ice, DNA binds to 
-the surface of the 
-bacterium as a calcium-
-phosphate-DNA 
-complex
-Following a sudden 
-increase in 
-temperature, one or 
-more DNA molecules 
-bound to the surface of 
-the cell is taken up by 
-the competent cell
-
-How can we selectively grow bacteria 
-that have taken up the plasmid?
-
-Selection pressure
-✓ ampR gene encodes for beta-lactamase
-✓ Inactivates ampicilin antibiotics
-✓ Only cells containing vector DNA will grow
-in the presence of ampicilin
-Selection based on antibiotic resistance
-
-How do we select for bacteria with the plasmids 
-carrying the inserts?
-By: Maya Kostman
-
-More detailed info: thermofisher.com
-LacZ gene naturally found in E. coli, encodes β-galactosidase.
-We use an E.coli strain that carries the LacZ deletion mutant which
-contains the omega-peptide but lacks the alpha-peptide and is therefore
-non-functional. The plasmid we use carries the alpha-peptide, rescuing the
-function of mutant beta-galactosidase.
-Blue-white screening 
-
-Lab Schedule
-• Monday (11/24)
-Introductory lecture 12:15 – 13:00
-Lab 13:15 – 14:00 Groups 1-19
-Lab 14:15 – 15:00 Groups 20-38 
-• Tuesday (11/25)
-Lab 11:15 – 11:45 Groups 1-19 
-Lab 12:00 – 12:30 Groups 20-38
-• Wednesday (11/26) Groups 1-19 
-Introductory lecture 8:15 – 9:00
-Lab 09:15 – 16:00
-• Thursday (11/27) Groups 20-38
-Introductory lecture 8:15 – 9:00
-Lab 9:15 – 16:00
-Deadline for submitting lab reports: 07/12/2025
-
-Working in the lab
-✓ Work in groups of 2 people, stick to your assigned partner 
-✓ Always wear gloves and lab coat to protect you and your samples, 
-wash your hands thoroughly before leaving the lab
-✓ When using the pipette, check the volume limits (0.1-10μl, 10-200μl, 
-and 100-1000μl)
-✓ Pipette into the bottom of the tube, do not ”shoot” it (especially when
-working with very low volumes)
-
-Transformation of competent cells
-→ performed during this lab (day 1)
-✓ 1 tube of plasmids (P) (with/without insert)
-✓ 1 tube of competent bacteria (C)
-
-Day 1: Selection of transformed cells
-→ performed during this lab (day 1)
-✓ Pick up bacterial colonies (2 white, 2 blue) from plate
-✓ Grow in LB medium with antibiotics (expand the colony and replicate plasmids)
-Day 2: Picking & expansion of blue and white
-colonies
-→ performed during this lab (day 2)
-
-Day 1: Materials for Transformation
-Falcon tube (50ml) LB-agar plate Eppendorf tube 
-Day 1: Spread plate method
-o Apply light pressure to not tear or stab the agar
-
-Day 3 - work overview
-✓ Purify plasmids 
-✓ Restriction enzyme digestion
-✓ Run on agarose gel
-✓ Interpret results
-
-Lab reports
-✓ Write according to the guidelines on the handout on Canvas
-✓ One lab report per group (your names and project group number on 
-the cover page)
-✓ In English
-✓ Upload your lab reports on CANVAS deadline on 07/12/2025
-
-Lecture Questions
-1. Name three applications of molecular cloning.
-2. What is a plasmid?
-3. Name the three main steps involved in recombinant DNA technology?
-4. What is a restriction enzyme?
-5. What are the bacteria used in your protocol?
-6. Explain the calcium/phosphate (heat-shock) method and what it is used for.
-7. How can we selectively grow bacteria that have taken up the plasmid?
-8. Explain the principle behind blue and white screening and its purpose in this
-lab.
-
-References
-Kehoe A (1989). "The story of biosynthetic human insulin". In Sikdar SK, Bier M, Todd PW (eds.).
-Frontiers in Bioprocesssing. Boca Raton, FL: CRC Press. ISBN 978-0-8493-5839-5.
-https://www.sigmaaldrich.com/SE/en/technical-documents/technical-article/genomics/cloning-and
-expression/blue-white-screening
-https://www.nlm.nih.gov/exhibition/fromdnatobeer/exhibition-interactive/recombinant
-DNA/recombinant-dna-technology-alternative.html
-Khan, S., Ullah, M. W., Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Role of 
-Recombinant DNA Technology to Improve Life. International journal of genomics, 2016, 2405954. 
-https://doi.org/10.1155/2016/2405954
-https://www.thermofisher.com/se/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen
-school-of-molecular-biology/molecular-cloning/cloning/traditional-cloning-basics.html
-