vault backup: 2025-12-08 19:58:36
All checks were successful
Deploy Quartz site to GitHub Pages / build (push) Successful in 1m47s
All checks were successful
Deploy Quartz site to GitHub Pages / build (push) Successful in 1m47s
This commit is contained in:
@@ -1,230 +0,0 @@
|
||||
# Att utforska proteiner
|
||||
**Sahlgrenska Akademin – LPG001 Biokemi – 2025-11-17**
|
||||
**Linda Johansson, Ph.D. – linda.johansson.4@gu.se**
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Innehåll
|
||||
- Begreppet ”proteom”
|
||||
- Skillnader i proteiners kemiska och fysikaliska egenskaper och hur dessa ligger till grund för olika reningsprinciper:
|
||||
- gelfiltrering
|
||||
- jonbyteskromatografi
|
||||
- affinitetskromatografi
|
||||
- Principer och tillämpning av elektrofores (SDS-PAGE)
|
||||
- Översiktlig beskrivning av proteinanalys med immunologiska tekniker och ”blottning”
|
||||
- antikroppar och antigen
|
||||
- skillnad mellan monoklonala och polyklonala antikroppar
|
||||
- principen för ELISA
|
||||
- kliniska exempel
|
||||
- Masspektrometri – introduktion
|
||||
- Förutsättningar för proteinstrukturbestämning med:
|
||||
- röntgenkristallografi
|
||||
- NMR
|
||||
- kryo-EM
|
||||
och deras medicinska applikationer
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Varför studera proteiner?
|
||||
- Forskning:
|
||||
- strukturbiologi – hur proteiner ser ut
|
||||
- biokemi – vad de binder
|
||||
- var de finns i kroppen
|
||||
- hur de påverkar sjukdomar
|
||||
- Klinik:
|
||||
- HIV-test (antikroppar, ELISA)
|
||||
- COVID-19 (antigen, antikropp, ELISA)
|
||||
- Myelom (detektion av IgM med proteinelektrofores)
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Proteiner
|
||||
- Proteiner utför viktiga funktioner i de flesta biologiska processer, t.ex. DNA-replikation och signalöverföring.
|
||||
- Sensoriska funktioner som smak, lukt, temperatur och beröring bygger på proteiner.
|
||||
- Aminosyrasekvensen bestämmer konformationen (3D-strukturen) och därmed funktionen.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Proteiner – 2024 års Nobelpris
|
||||
- Handlar om proteiners strukturer och hur de kan designas och förutsägas.
|
||||
- David Baker: byggt helt nya proteiner.
|
||||
- Demis Hassabis & John Jumper: AI-modellen AlphaFold som löser strukturförespådningsproblemet.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Genom vs proteom
|
||||
- **Genom:** komplett DNA-sekvens (~3 miljarder baser, ca 23 000 gener).
|
||||
- **Proteom:** de proteiner som uttrycks av en cell vid en given tidpunkt.
|
||||
- Proteomet påverkas av:
|
||||
- celltyp
|
||||
- tidpunkt
|
||||
- proteininteraktioner
|
||||
- posttranslationella modifieringar
|
||||
- Proteomet är mycket dynamiskt och komplext.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Hur kan vi studera proteiner?
|
||||
- Vi behöver rena fram ett specifikt protein ur cellens innehåll.
|
||||
- Proteiner skiljer sig i:
|
||||
- storlek
|
||||
- laddning
|
||||
- löslighet
|
||||
- bindningsaffinitet
|
||||
- Egenskaperna används i reningsmetoder.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Preparation av protein – homogenisat
|
||||
- Celler bryts upp → homogenisat.
|
||||
- Centrifugering separerar komponenter:
|
||||
- **pellet:** i botten
|
||||
- **supernatant:** ovanför
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Kromatografi – princip
|
||||
- Små kulor/beads med definierade egenskaper packas i en kolonn (fast fas).
|
||||
- Buffert + prov rör sig genom kolonnen (mobil fas).
|
||||
- Olika typer används beroende på proteinets egenskaper.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Gelfiltrering – separation efter storlek
|
||||
- Porösa kulor släpper in små molekyler men inte stora.
|
||||
- **Stora proteiner kommer ut först.**
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Jonbyteskromatografi – separation efter laddning
|
||||
- Proteinets totala laddning styr bindning.
|
||||
- **Anjonbytare:** binder negativa grupper.
|
||||
- **Katjonbytare:** binder positiva grupper.
|
||||
- Eluering sker med pH-ändring eller saltgradient.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Affinitetskromatografi – separation efter selektivitet
|
||||
- Specifik bindning mellan protein och ligand.
|
||||
- Exempel: 6×His-tag → stark bindning till Ni²⁺-kolonn.
|
||||
- Eluering ofta med imidazol.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Analys av proteinrening
|
||||
- Flera reningssteg kombineras.
|
||||
- Man följer renheten vid varje steg.
|
||||
- Val av metod beror på:
|
||||
- önskad renhet
|
||||
- proteinets egenskaper
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Gelelektrofores – princip
|
||||
- Molekyler med nettoladdning vandrar i elektriskt fält.
|
||||
- Polyakrylamidgel separerar efter storlek.
|
||||
- Små proteiner rör sig snabbare.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## SDS-PAGE
|
||||
- SDS ger uniform negativ laddning proportionell mot massa.
|
||||
- Separation sker enbart på **storlek**.
|
||||
- Efter körning färgas gelen (Coomassie blue).
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## SDS-PAGE i reningskontroll
|
||||
- Prover tas efter varje reningssteg.
|
||||
- Rätt band ska bli tydligare och renare för varje steg.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Gelfiltrering vs SDS-PAGE
|
||||
- **Gelfiltrering:** störst först, används för rening.
|
||||
- **SDS-PAGE:** minst först, används för analys.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Antikroppar och antigen
|
||||
- Antikroppar → proteiner som känner igen antigen.
|
||||
- Del av antigenet som känns igen = **epitop**.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Monoklonala vs polyklonala antikroppar
|
||||
- **Monoklonala:** känner igen exakt samma epitop.
|
||||
- **Polyklonala:** mix som känner igen flera epitoper på samma antigen.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## ELISA – princip
|
||||
- Enzymbundet antikroppssystem som ger färg vid substrattillsats.
|
||||
- Två huvudtyper:
|
||||
- **Indirekt ELISA:** detekterar antikroppar (t.ex. HIV)
|
||||
- **Sandwich ELISA:** detekterar antigen (t.ex. COVID-19)
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Western Blot
|
||||
- SDS-PAGE → proteiner förs över till membran.
|
||||
- Inkuberas med primär + sekundär antikropp.
|
||||
- Signal mäts via enzym eller fluorescens.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Masspektrometri – princip
|
||||
- Identifierar peptider/proteiner.
|
||||
- Möjliggör analys av posttranslationella modifieringar.
|
||||
- Peptider joniseras → accelereras → separeras efter massa (t.ex. MALDI-TOF).
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Masspektrometri – användning
|
||||
- Identifiera proteiner
|
||||
- Verifiera rening
|
||||
- Kartlägga PTM
|
||||
- Analysera sekvens och evolutionärt ursprung
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Proteiners 3D-struktur
|
||||
- Bestäms av aminosyrasekvens.
|
||||
- Experimentella metoder krävs ofta trots AI-prediktioner som AlphaFold.
|
||||
- Struktur är centralt för läkemedelsutveckling.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## NMR
|
||||
- Baserad på magnetiska atomkärnor.
|
||||
- Resonans påverkas av atomernas omgivning.
|
||||
- Typer:
|
||||
- 1D NMR – veckningsinformation
|
||||
- NOESY – avstånd mellan protoner (<5 Å)
|
||||
- Begränsning: protein <50 kDa
|
||||
- Resultat: ensemble av möjliga strukturer.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Röntgenkristallografi
|
||||
- Proteinet kristalliseras.
|
||||
- Kristall bestrålas med röntgen → diffraktionsmönster samlas.
|
||||
- Matematiskt → elektrondensitetskarta → modell av struktur.
|
||||
- Hög upplösning ger mer detaljer.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Kryo-EM
|
||||
- Direkt visualisering av frys-införda molekyler.
|
||||
- Kräver inga kristaller eller isotoper.
|
||||
- Single-particle-analys möjlig.
|
||||
- Snabb metodutveckling → dominerande teknik idag.
|
||||
- Upplösning beror på proteinets storlek.
|
||||
- Nobelpris 2017.
|
||||
|
||||
---
|
||||
|
||||
## Kryo-EM – procedur
|
||||
- Protein fryses på grid i flytande helium.
|
||||
- Exponeras för elektronstråle i vakuum.
|
||||
- Många 2D-bilder sammanställs → 3D-struktur.
|
||||
Reference in New Issue
Block a user