vault backup: 2025-12-09 15:12:34

content/Biokemi/Plasmidlabb/Anteckningar I.md

@@ -0,0 +1,126 @@
+---
+föreläsare: Oliver Forsell
+tags:
+  - biokemi
+  - anteckningar
+  - rekombinant-dna-teknik
+---
+Rekombinant DNA-teknik
+
+Steg
+- Molekylär kloning
+	- använder sig av en DNA snutt, en reflektionsenzym
+	- foga in det i en slags vektor, ofta i en plasmid
+	- Samma plasmid har förmåga klippa iihop samma baspar
+	- foga ihop sin DNA
+		- med hjälp av vegasenzym
+- Transformationen
+	- För in den här vektor i en värd-cell
+- Selektera och replikera
+	- Växa den i fermentortankar, så man får tillräckligt mycket av sitt material
+
+#### Plasmider
+
+Dubbelsträngat ciruklärt DNA, finns i de flesta bakterier.
+Självreplikera vid celldelning och gemensama gener
+t.ex. anti-biotikaresistens som bakterierna kan dela med sig
+kraftfullt verktyg som vi har lyckats att kapa
+
+Hur kan vi använda oss av det här?
+
+### Applications
+
+- Biomedicinska lösningar, t.ex. vaccin Hepatit-B 
+	- Framställer ett ytprotein på bakterien, istället för att injecra ett helt virus, det räcker med själva proteinet för att starta immunförsvaret istället för en riktig virus
+	- Produktion av insulin
+		- jästceller istället för bakterier
+		- post-transationella modifieringar
+		- de är eukaryota celler, så det krävs för insulin
+	- Koaguleringsfaktor-8
+
+GMO
+- Använder man av rekombinant DNA-teknik för att skapa, 
+- t.ex. resistens mot en herbicid
+Genterapi
+- CRISPR/Cas9 framställer man på det sättet
+- Kan ersätta delar av vårat DNA
+- behöver en vektor, för att transportera in
+	- Adeno-virus är en vanlig vektor, som man producera rekombinant
+Genanalys
+- polymeraser, Polymerace-Chain-Reaction. 
+	- en teknik för att detektera närvaron av ett viss protein
+	- de kan kopiera en molekyl många gånger
+	- specifika temperaturer med hjälp av rekombinant
+
+
+### Verktyg som behövs
+- "saxar", som kan bryta ner
+- "capping site" en plats i plasmiden där själva urklippandet kan ske
+	- en sekvens med baspar som enzymet känner igen
+- "limmet", dna-ligaser så det går att foga fast
+- värd-cell, ofta bakterieceller
+- rätt miljö, LP-medium ett slags näringsmedel som bakterier trivs i
+	- ska göra massa olika kopier, ofta proteiner av det
+
+### Vektorer
+Själva plasmiden, en slags molekyl som kan transportera DNA som vi är intresserad av
+
+En viktig del är 
+- Ori - origin of replication
+- massa olika baspar, som olika restriktionsmolekyler kan känna igen
+- AmpR: kan producera β-laktamas, den förhindra verkan av ampicilin
+- Promotor krävs för att pol ska kunna binda och uttrycka en gen
+- LacZ alpha: poängen 
+	- när vi inte fogat in våran gen är LacZ kontakt
+	- om vi för in den, bryter vi upp LacZ, för det vi klipper är i mitten av det
+	- om man inte fört in kommer LacZ kommer binda till alpha-peptiden i β-kalaktas
+	- Muterad E Coli-stammen så den har inte i sitt vanliga DNA den här alpha-peptiden, bara delta-delen,
+		- för att e coli ska kunna producera en b-kalaktas
+- IPTG inaktivar repressor genet
+	- om vi tillsätter IPTG så kommer det vara fritt fram att uttrycka alpha-
+
+### Restriktionenzymer
+- BamH I
+	- GGATC
+	- Generera strick enzo
+	- klipper snett för att det är lättare att sammanfoga sen
+
+### Värd-cell: E. Coli
+Vanligt modellorganism
+Gram negativ
+- den färgas rosa (positiva lila) med graminfärgning
+- de har tunt membranvägg
+- grovt dela upp bakterierar i de som har/inte har de yttre höljet
+Finns naturligt i tjocktermen
+
+
+### Insulin
+Började produceras 1920-talet
+Krävdes upp till 70 grisar för att hålla en person levande i ett år utan rekombinant DNA-teknik
+Utvann från bukspottskörteln, 1g på 70 grisar
+1970 utvecklades rekombinant DNA-teknik, kommerciellerades på 1980-talet
+
+### Labsyfte
+Ska avgöra om våran gen av intresse har lyckats klona in i vektorn
+Fokus är inte gen, mer på själva processen
+t.ex. insulin
+
+## Transformation
+
+Vi kommer använda oss av rekombinanta plasmider och kombinera de med e coli-celler
+Cellerna måste vara mottagliga för att ta upp plasmiden
+Calciumjoner neutraliserar den negativa ytan (fosfoliper och glykoliper), så att DNA kan närma sig ytan det är också negativt
+Sen höjer man med en värmsjuk, membranet blir permeabiliserat.
+
+blue-white screening
+lacz kommer naturligt med e coli, mutantsträng som saknar alphadelen.
+
+En analog till en galaktosias, den heter X-gal, när den bryts ner bildas galaktos, men den bildar också 4-chloro-3-bromo-indigo som gör att det blir blå, då kan vi se vilka bakteriera som har en intakt lacZ eller inte.
+
+De som har våran gen av intresse blir inte färgade, de är svåra att se, men inte osynliga.
+
+Western Blot kan man använda för att identifiera ett protein av intresse
+
+
+
+

content/Biokemi/Plasmidlabb/Anteckningar II.md

@@ -0,0 +1,89 @@
+---
+tags:
+  - biokemi
+  - rekombinant-dna-teknik
+  - anteckningar
+föreläsare: Oliver Forsell
+date: 2025-11-26
+---
+Sätter dit en prime av intresse, restriktionssite. En insert som med hjälp av restriktionsenzym kan kapa och får en sticky ends.
+
+self-ligated vector, plasmiden binder till sig själv, isolera med blue/white.
+
+ampicillin?
+x-gal?
+iptg? lacz-alpha restriction, sitter ett repressionprotein, iptg inaktiverar en repressor
+AmpR: ampicillin restistans
+pellet?
+supernatant: det som hamnar ovanpå
+nukleasfritt vatten
+kilator? ko-faktor för vatten
+RnasaA: bryter ner RNA
+SDS löser upp fosfolipider och proteiner i cellmembranet
+eulera
+SYBR safe
+
+
+
+---
+
+Dagens labb
+
+# Rena fram plasmiden
+
+# Klippar ur genen av intresse
+
+# Kör agarose gel
+
+# Tolka resultatet
+
+
+
+----
+
+### What are the sites the plasmid contains that allow for this experiment? 
+- Lacz
+- Β-lactamas (ampicilin resistansen)
+- BamH-insertion site, i vårta multiple cloning site
+- Origin of replication för att kunna replikera
+
+#### What are the 3 compounds in the LB plates that allow for selection of bacteria with plasmid and the distinction of plasmids with and without the inserted gene?
+- IPTG
+- X-Gal
+- Ampicillin
+
+### What are the six steps in plasmid preparation and purification? 
+1. Pelleteringen
+2. **Suspendera**, lösa upp pelleten
+3. **Lysering** - så det läcker ut plasmid
+4. **Neutralisera** - skyddar plasmiden på nytt
+5. **Skölja bort salter**
+6. Tillsätta vatten för att eulera ut vår plasmid
+
+
+### What is a restriction enzyme and why was it used in this experiment? 
+
+Hjälpa till att klippa ut genen och foga in vår plasmid, sticky ends
+
+
+### Explain the principle of Gel Electrophoresis, what is it for? 
+
+Separation av storlek eller massa på våra DNA-fragment. Elektrostatiskt repulsion, som får våra joner att separeras
+
+### What´s the compound that allows for the visualization of the DNA in the gel?
+
+SYBR safe
+
+### How many times does BamHI cut the plasmid without the insert? And the plasmid with the insert? 
+
+Hur många gånger kommer BamHI klippa vår plasmed
+- utan insert: 1  
+- med insert: 2 på var sin sida om inserten för att få ut den
+
+### Explain the different plasmid conformations that exist.
+
+- relaxed
+- supercoiled supper snabbt, de är tvinnade
+- linjära
+-
+

content/Biokemi/Plasmidlabb/Förståelse.md

@@ -0,0 +1,89 @@
+Vektorer är DNA-molekyler (t.ex. plasmider) som har specifika klipp- och infogningsställen där man kan sätta in gener för kloning eller uttryck.
+
+När man klipper DNA använder man restriktionsenzymer, som känner igen och klyver specifika sekvenser.
+
+MCS (multiple cloning site) är en kort DNA-region i en vektor som innehåller många unika restriktionsställen där man kan klippa och sätta in gener.
+
+Man ligerar DNA med DNA-ligas, ett enzym som kopplar ihop ändarna genom att skapa fosfodiesterbindningar.
+
+BamH I är ett restriktionsenzym
+
+Klyvning kan ge två typer av ändar: sticky ends (överhängande ändar) och blunt ends (trubbiga ändar).
+
+E. coli används eftersom den växer snabbt, är lätt att odla och genetiskt manipulera, och vi känner dess genom mycket väl.
+
+### Dag 1 & 2:
+- Genen lacZ i E. coli kodar för enzymet β-galaktosidas
+- IPTG är en inducer som behövs för att slå på lacZ, så att enzymet faktiskt bildas
+- X-gal är ett konstgjort substrat, som blir blått när de klyvs av β-galaktosidas
+- X-gal och 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-Galactopyranoside är samma sak
+- Normalt klyver enzymet β-galaktosidas X-gal → blått färgämne bildas
+- För att substratet ska bli blått krävs lacZ, IPTG och X-gal. Saknas några av dem blir det inte blått
+- Ampicillin dödar bakterier som inte har plasmiden, så bara de vi vill studera överlever.
+- Heat-shock 0->37 grader skapar en tryckskillnad och öppnar porer i membrandet så plasmid-DNA kan ta sig in i cytoplasman
+	- Nerkylning direkt efteråt gör att de stannar kvar
+- LB-plattan är både odlingsmedium och selektions-/screeningsverktyg
+	- näring (aminosyror, mineral, salt, tillväxtfaktorer osv)
+	- ampicillin dödar allt utan plasmid
+	- IPTG slår på lacZ
+	- X-gal infärgning
+
+### Dag 3
+
+#### A. Förbered plasmiden
+
+Cellerna centrifugeras, spräcks och plasmiden separeras från cellskräpet. Plasmiden fångas sedan upp i en spin-kolonn, tvättas ren och sköljs ut i en ny tub.
+
+![[Pasted image 20251128104012.png]]
+
+Vi har två lösningar i separata falkonrör, en blå (utan våran insert) och en vit (med vår insert). Upprepa alla stegen för varje lösning.
+
+| Steg            | Input                | Output                                 | Kort beskrivning                                                |
+| --------------- | -------------------- | -------------------------------------- | --------------------------------------------------------------- |
+| 1. Pelletera    | Bakteriekultur       | Cellpellet + borttagen supernatant     | Celler centrifugeras ned till botten.                           |
+| 2. Lös upp      | Cellpellet + A1      | Jämn cellsuspension                    | Löser upp pelleten så lysering kan fungera.                     |
+| 3. Lysera       | Cellsuspension + A2  | Lyserad lösning                        | Cellmembran öppnas, plasmid + DNA/proteiner frigörs.            |
+| 4. Neutralisera | Lyserad lösning + A3 | Fällt skräp + plasmid i lösn.          | Stora DNA/proteiner klumpar ihop sig. Plasmiden stannar löslig. |
+| 5. Centrifugera | Neutraliserad mix    | Pellet (skräp) + supernatant (plasmid) | Plasmiden separeras från cellskräp.                             |
+| 6. Ladda kolumn | Supernatant          | Plasmid bundet till kolumn             | Plasmiden fastnar på membranet; skräp rinner igenom.            |
+| 7. Tvätta       | Kolumn + A4          | Renad kolumn                           | Tar bort salter, proteiner och kvarvarande föroreningar.        |
+| 8. Torka kolumn | Tvättad kolumn       | Torr kolumn                            | Extra spinn för att avlägsna etanolrester.                      |
+| 9. Skölj        | Kolumn + vatten      | Ren plasmid-DNA i eppendorf            | Vattnet löser av plasmiden från membranet.                      |
+Vi får nu ut en ren plasmid
+
+#### B. klyv plasmiden med BamHI och jämför den med en oklippt kontroll.
+
+Skapa en BamHI-enzym som kan klippa plasmiden, klipp plasmiden och tillsätt färgnings
+
+Master solution:
+- vatten, buffert och enzym blandas in
+
+Digested = cut = plasmid som har blivit klippt vid BamHI-sajten
+Cybr safe gör det synligt i UV-ljus utan att vara cancerframkallande
+loading dye gör att vi kan se vad vi pipeterar in i elektroforesen i nästa steg
+
+![[Pasted image 20251128104645.png]]
+
+
+| Steg                          | Input                     | Output                           | Kort beskrivning                                     |
+| ----------------------------- | ------------------------- | -------------------------------- | ---------------------------------------------------- |
+| 1. Gör BamHI-mastermix        | H₂O + 10× buffer + BamHI  | Färdig enzymmix                  | Blandar så alla prover får samma enzym och buffer.   |
+| 2. Fördela plasmider          | Plasmid-DNA               | Tub “white-cut” + tub “blue-cut” | Flyttar plasmiderna till nya rör för klippning.      |
+| 3. Tillsätt master + inkubera | Plasmid + BamHI-mastermix | Digesterat (klippt) DNA          | Enzymet klipper plasmiden vid BamHI-sajten.          |
+| 4. Tillsätt loading dye       | Klippt DNA + dye          | Färdiga “cut”-prover för gel     | Gör proverna tyngre och synliga i gelen.             |
+| 5. Gör oklippta kontroller    | Plasmid + loading dye     | “white-uncut” + “blue-uncut”     | Referensprover som visar hur odigesterat DNA ser ut. |
+
+Du blandar en BamHI-lösning, blandar den med plasmiderna och låter enzymet klippa DNA:t vid 37 °C. Sedan tillsätter du loading dye och gör även två oklippta kontroller för jämförelse i gelen.
+
+
+#### Steg 3
+
+Elektrofoera och läs av i UV-ljus
+
+![[Pasted image 20251128104949.png]]
+
+| Steg                         | Input                       | Output                           | Kort beskrivning                              |
+| ---------------------------- | --------------------------- | -------------------------------- | --------------------------------------------- |
+| 7. Ladda prover              | Marker + cut/uncut-prover   | Gel med laddade prover           | Proverna placeras i rätt ordning i brunnarna. |
+| 8. Kör elektrofores          | Gel i tank + 120 V          | Separering av DNA-fragment       | DNA vandrar efter storlek genom gelen.        |
+| 9. Fotografera               | Färdigkörd gel              | UV-bild med DNA-band             | Bandmönstret visar plasmidens storlek/insätt. |

content/Biokemi/Plasmidlabb/Instuderingsfrågor.md

@@ -0,0 +1,24 @@
+---
+tags:
+  - biokemi
+  - instuderingsuppgifter
+  - plasmid
+---
+#### Name three applications of molecular cloning. 
+#### What is a plasmid? 
+#### Name the three main steps involved in recombinant DNA technology? 
+#### What is a restriction enzyme? 
+#### What are the bacteria used in your protocol? 
+#### Explain the calcium/phosphate (heat-shock) method and what it is used for. 
+#### How can we selectively grow bacteria that have taken up the plasmid? 
+#### Explain the principle behind blue and white screening and its purpose in this lab.
+
+#### What are the sites the plasmid contains that allow for this experiment? 
+#### What are the 3 compounds in the LB plates that allow for selection of bacteria with plasmid and the distinction of plasmids with and without the inserted gene?
+#### What are the six steps in plasmid preparation and purification?
+#### What is a restriction enzyme and why was it used in this experiment? 
+#### Explain the principle of Gel Electrophoresis, what is it for? 
+#### What´s the compound that allows for the visualization of the DNA in the gel? 
+#### How many times does BamHI cut the plasmid without the insert? 
+#### And the plasmid with the insert? 
+#### Explain the different plasmid conformations that exist. Förståelse Biokemi / Plasmidlabb / 

content/Biokemi/Plasmidlabb/Rapport.md

@@ -0,0 +1,38 @@
+
+## Att göra
+- [ ] Samla ihop, infoga bilder
+- [ ] Skapa ordentliga referenser
+- [ ] Annotera resultat med korrekt storlek (rader) och namn på kolumner
+- [ ] Diskution: Svara på Olivers fråga angående vad som kan göras för att förbättra sannolikheten för att inte få in _vita_ ämnen i _blåa_ provet  
+- [ ] Se till att komprimera texten, så allt viktigt får plats på 3 sidor
+## Referenser
+
+- A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.
+	- H.C. Birnboim, J. Doly
+	- 1973
+	- [10.1093/nar/7.6.1513](https://doi.org/10.1093/nar/7.6.1513)
+- Nonchromosomal Antibiotic Resistance in Bacteria: Genetic Transformation of _Escherichia coli_ by R-Factor DNA
+	- Stanley N. Cohen, Annie C. Y. Chang, and Leslie Hsu
+	- 1972
+	- 10.1073/pnas.69.8.2110
+- New versatile cloning and sequencing vectors based on bacteriophage M13
+	- M P Kieny, R Lathe, J P Lecocq
+	- 1983
+	- 10.1016/0378-1119(83)90039-2
+- Restriction and modification enzymes and their recognition sequences
+	- R J Roberts
+	- 1985
+	- 10.1093/nar/13.suppl.r165
+- Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose--ethidium bromide electrophoresis
+	- P A Sharp, B Sugden, J Sambrook
+	- 1973
+	- 10.1021/bi00740a018
+---
+**Jackson, Symons & Berg (1972)**
+
+_Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40: Circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli._
+PNAS 1972.
+PMCID: PMC389671
+PMID: 4342968
+
+→ Nobelpriset 1980 till Paul Berg

content/Biokemi/Plasmidlabb/Slides II.md

@@ -0,0 +1,187 @@
+Recombinant DNA technology
+Lecture by:
+Anne Wöhr
+anne.wohr@gu.se
+
+Molecular Cloning
+→ Performed beforehand (not done during this lab)
+
+Molecular Cloning
+→ Performed beforehand (not done during this lab)
+We aim to isolate/separate 
+these two plasmids to 
+select the recombinant 
+plasmid and to verify the 
+presence of the gene of 
+interest
+
+Day 1: Transformation of competent cells
+→ performed during this lab (day 1)
+
+Day 1: Selection of transformed cells
+→ performed during this lab (day 1 + day 2)
+
+Day 2: Picking & expansion of blue
+and white colonies
+→ performed during this lab (day 2)
+
+Revision 
+Blue-white screening
+Plasmid:
+• AmpR: Ampicillin resistance (β-lactamase)
+• LacZ: α-peptide for functional β-galactosidase 
+enzyme
+• BamHI restriction site in LacZ gene for 
+insertion of DNA
+Growth medium:
+• Ampicillin: Only successfully transformed 
+bacteria carrying plasmids can survive in the 
+presence of ampicillin
+• IPTG : activates transcription of the LacZ gene 
+by binding its repressor
+• X-gal: β-galactosidase degrades X-gal. The 
+product has a blue colour!
+
+Day 3 - work overview
+✓ Purify plasmids 
+✓ Restriction enzyme digestion
+✓ Run on agarose gel
+✓ Interpret results
+
+Day 3: Material
+Spin column
+Tubes labeled with
+A1; A2; A3; A4; H2O
+Plasmid preparation kit
+Collection tube & 
+spin column (blue)
+
+Day 3: Plasmid purification
+→ performed during this lab (day 3)
+Buffer A1 (Cell Suspension)
+Tris/HCl (pH 8.0), EDTA, RNase A
+Buffer A2 (Cell Lysis)
+NaOH; SDS
+Buffer A3 (Neutralization/Binding)
+Contains acetate and guanidine 
+hydrochloride
+Buffer A4 (Wash, reconstituted)
+Contains ethanol, NaCl, EDTA, and 
+Tris/HCl
+
+cells grown in LB-
+media overnight
+Transfer 2x 750 µl into 
+microcentrifuge tube 
+Bacterial pellet = cells + plasmid
+→ Discard superatant
+Balance the centrifuge
+Day 3: harvest cells & purify plasmids
+A1 - resuspension buffer
+A2 – cell lysis buffer
+A3 – neutralization/ 
+binding buffer
+Plasmid in supernatant
+cell debris as pellet
+transfer supernatant
+to column
+Plasmid binding
+Discard 
+flow-through
+Wash with A4
+Transfer column to new tube
+add H2O to elute plasmid
+
+QIAprep Miniprep Handbook, Appendix A: Background Information, Preparation of cell lysates, p 43 
+Plasmid purification
+Buffer A1: 
+Bacterial cells are resuspended in a buffer containing Rnase A.
+Buffer A2: 
+Bacteria are lysed under alkaline conditions (NaOH). SDS solubilizes the phospholipid 
+and protein components of the cell membrane
+Lysis and release of cells contents. Alkaline conditions: denaturation of chromosomal 
+and plasmid DNA as well as proteins.
+Buffer A3: 
+The lysate is neutralized and adjusted to high-salt-binding conditions. The high salt 
+concentration causes denatured proteins, chromosomal DNA, cellular debris, and SDS 
+to precipitate, while the smaller plasmid DNA renatures correctly and stays in solution. 
+DNA is bound to silica membrane of spin columns in high-salt buffer. RNA, cellular 
+proteins and metabolites are not retained on the membrane.
+Buffer A4: 
+Washing and reconstitution of DNA. Salts are efficiently removed by this wash step.
+H2O: 
+The purified plasmid DNA is eluted from silica membrane by addition of water. The 
+elution is pe is dependent on a low salt concentration and a stable pH (pH 7-8.5).
+
+Restriction enzyme working solution:
+Restriction enzyme buffer
+H2O
+Restriction enzyme (keep it cold!)
+Add restriction enzyme to a portion of eluted plasmid
+KEEP THE REST OF UNDIGESTED PLASMID AS CONTROLS FOR 
+LATER USE Incubate at 37°C for 60 min 
+Day 3: Restriction enzyme digestion
+
+Day 3: Restriction enzyme digestion
+Plasmid without insert (2700 bp)
+Plasmid with insert in BamHI site (4200 bp)
+Cut with BamHI → bands at 2700 bp and 1500 bp
+
+• Samples are mixed with 6x loading
+dye to make them ”heavier” to stay
+in wells
+• Separation of DNA molecules
+based on their size 
+• DNA negatively charged
+• Agarose gel for separation
+• Shorter molecules move faster and 
+migrate farther than longer ones
+• Visualization of DNA with SYBR 
+safe DNA stain
+Day 3: Agarose Gel Electrophoresis
+
+GeneRuler 1kb DNA ladder = size marker
+marker
+2700 bp
+1500 bp
+4200 bp
+Day 3: Expected Results
+
+• Relaxed/linear: intact circle but “nick” in one strand
+• Linear: both strands are cut (at the same location)
+• Supercoiled: fully intact with both strands uncut, appears in a compact 
+form
+Plasmid conformation affects migration
+
+Lab schedule
+✓ Purify plasmids 
+✓ Restriction enzyme digestion
+1-2h incubation time → lunchbreak and 
+everyone will be back at the same time
+✓ Run on agarose gel
+approximately 1h → go through the
+expected results to be able to ask
+appropriate questions
+✓ Interpret results
+make sure to ask a lot of questions while you have
+the chance!!!
+
+Lab reports
+✓ Write according to the guidelines on the handout on Canvas
+✓ One lab report per group (Names and group number on the cover page)
+✓ In English
+✓ Upload your lab reports on CANVAS, deadline 07/12/2025
+
+Lecture Questions
+1. What are the sites the plasmid contains that allow for this experiment?
+2. What are the 3 compounds in the LB plates that allow for selection of
+bacteria with plasmid and the distinction of plasmids with and without
+the inserted gene?
+3. What are the six steps in plasmid preparation and purification?
+4. What is a restriction enzyme and why was it used in this experiment?
+5. Explain the principle of Gel Electrophoresis, what is it for?
+6. What´s the compound that allows for the visualization of the DNA in
+the gel?
+7. How many times does BamHI cut the plasmid without the insert? And
+the plasmid with the insert?
+8. Explain the different plasmid conformations that exist.

content/Biokemi/Plasmidlabb/Slides.md

@@ -0,0 +1,219 @@
+Recombinant DNA technology
+Lecture by:
+Anne Wöhr
+anne.wohr@gu.se
+
+Recombinant DNA technology
+Molecular cloning Transformation Selection and 
+Replication
+Performed during this lab
+
+Plasmids
+• Commonly found in bacteria as extra-chromosomal 
+circular dsDNA molecules 
+• Able to self-replicate during cell division
+• Often carry beneficial genes like antibiotic resistance
+• Bacteria can share genetic information through 
+plasmid transfer
+By: Maya Kostman
+How could this be useful for us?
+
+Applications of recombinant DNA 
+technologies
+Khan S., 2016
+Biopharmaceuticals:
+Vaccines eg hepatitis B vaccine
+recombinant proteins eg Insulin (Diabetes), Factor VIII (hemophilia)
+Genetically modified organisms: 
+Organisms that have been genetically modified to exhibit specific traits eg 
+herbicide-resistant crop plants
+Gene Therapy: 
+In some genetic disorders, patients lack the functional form of a gene. Gene 
+therapy attempts to provide a normal copy of the gene to the cells of the 
+patient.
+Gene Analysis: 
+build artificial, recombinant versions of genes that help understand how 
+genes in an organism function
+
+• Scissors: DNA restriction enzymes (DNA digestion)
+• Cutting sites: multiple cloning sites (MCS)
+• Glue: DNA ligase (DNA ligation)
+• Host: bacterial cells (Transformation)
+• Environment: LB medium or LB agar plates (Culturing)
+• Goal: making more identical copies, or expression (making proteins)
+Toolbox for molecular cloning
+
+✓ DNA molecule that acts as a vehicle to carry foreign genetic materials 
+into another cell, where it can be replicated or expressed.
+Vectors
+Ori (origin of replication): 
+Replication is initiated here, enabling the plasmid to reproduce itself.
+MCS (multiple cloning site):
+Short segment of DNA which contains many restriction sites. This
+allows a piece of DNA to be inserted into that region. The used
+plasmid contains a BamHI cleavage site in its MCS.
+AmpR gene: 
+encodes the enzyme beta-Lactamase, which inactivates ampicillin.
+Cells containing a plasmid vector which expresses AmpR can be
+selected from those that do not by growth in an ampicillin-containing
+medium.
+Lac promoter: 
+binding site of RNA polymerase to initiate expression. IPTG binds
+and inactivates the LacI repressor protein and thereby enables
+expression of genes downstream of the promoter.
+LacZ⍺ gene: 
+encodes the alpha-peptide of the enzyme beta-galactosidase.
+Functional beta-galactosidase consits of the alpha- and omega-
+peptide. The used E-coli strain carries the lacZ deletion mutant
+which contains the omega-peptide but lacks the alpha-peptide. The
+activity of mutant beta-galactosidase is rescued by the presence of
+the alpha-peptide present in the plasmid (alpha-complementation).
+
+Restriction enzymes (Scissors)
+✓ Sequence-specific DNA endonucleases
+✓ Recognise and cleave DNA sequences at specific restriction sites
+✓ Generate “sticky end” or “blunt end”
+
+Escherichia coli (Host)
+✓ Model organism in molecular biology
+✓ Gram negative, rod shaped bacteria
+✓ Located in lower intestine
+
+The History of Insulin Production
+1921: Discovery of insulin
+1922: Leonard Thompson became the first person with diabetes ever 
+treated through administration of insulin
+1923: Insulin is commercialized
+Insulin sales kit, Eli Lilly and Company, 1940s
+14 cows or 70 pigs to sustain a diabetic 
+patient for 1 year
+1970: Recombinant DNA technology is 
+developed
+1982: Recombinant insulin is commercialized 
+
+Production of Insulin
+Adapted from “From DNA to Beer: Harnessing Nature in Medicine & Industry”
+
+Purpose of this lab: 
+Determine whether a gene of interest has 
+been successfully cloned into a vector.
+
+Transformation
+
+Transformation
+During the incubation 
+on ice, DNA binds to 
+the surface of the 
+bacterium as a calcium-
+phosphate-DNA 
+complex
+Following a sudden 
+increase in 
+temperature, one or 
+more DNA molecules 
+bound to the surface of 
+the cell is taken up by 
+the competent cell
+
+How can we selectively grow bacteria 
+that have taken up the plasmid?
+
+Selection pressure
+✓ ampR gene encodes for beta-lactamase
+✓ Inactivates ampicilin antibiotics
+✓ Only cells containing vector DNA will grow
+in the presence of ampicilin
+Selection based on antibiotic resistance
+
+How do we select for bacteria with the plasmids 
+carrying the inserts?
+By: Maya Kostman
+
+More detailed info: thermofisher.com
+LacZ gene naturally found in E. coli, encodes β-galactosidase.
+We use an E.coli strain that carries the LacZ deletion mutant which
+contains the omega-peptide but lacks the alpha-peptide and is therefore
+non-functional. The plasmid we use carries the alpha-peptide, rescuing the
+function of mutant beta-galactosidase.
+Blue-white screening 
+
+Lab Schedule
+• Monday (11/24)
+Introductory lecture 12:15 – 13:00
+Lab 13:15 – 14:00 Groups 1-19
+Lab 14:15 – 15:00 Groups 20-38 
+• Tuesday (11/25)
+Lab 11:15 – 11:45 Groups 1-19 
+Lab 12:00 – 12:30 Groups 20-38
+• Wednesday (11/26) Groups 1-19 
+Introductory lecture 8:15 – 9:00
+Lab 09:15 – 16:00
+• Thursday (11/27) Groups 20-38
+Introductory lecture 8:15 – 9:00
+Lab 9:15 – 16:00
+Deadline for submitting lab reports: 07/12/2025
+
+Working in the lab
+✓ Work in groups of 2 people, stick to your assigned partner 
+✓ Always wear gloves and lab coat to protect you and your samples, 
+wash your hands thoroughly before leaving the lab
+✓ When using the pipette, check the volume limits (0.1-10μl, 10-200μl, 
+and 100-1000μl)
+✓ Pipette into the bottom of the tube, do not ”shoot” it (especially when
+working with very low volumes)
+
+Transformation of competent cells
+→ performed during this lab (day 1)
+✓ 1 tube of plasmids (P) (with/without insert)
+✓ 1 tube of competent bacteria (C)
+
+Day 1: Selection of transformed cells
+→ performed during this lab (day 1)
+✓ Pick up bacterial colonies (2 white, 2 blue) from plate
+✓ Grow in LB medium with antibiotics (expand the colony and replicate plasmids)
+Day 2: Picking & expansion of blue and white
+colonies
+→ performed during this lab (day 2)
+
+Day 1: Materials for Transformation
+Falcon tube (50ml) LB-agar plate Eppendorf tube 
+Day 1: Spread plate method
+o Apply light pressure to not tear or stab the agar
+
+Day 3 - work overview
+✓ Purify plasmids 
+✓ Restriction enzyme digestion
+✓ Run on agarose gel
+✓ Interpret results
+
+Lab reports
+✓ Write according to the guidelines on the handout on Canvas
+✓ One lab report per group (your names and project group number on 
+the cover page)
+✓ In English
+✓ Upload your lab reports on CANVAS deadline on 07/12/2025
+
+Lecture Questions
+1. Name three applications of molecular cloning.
+2. What is a plasmid?
+3. Name the three main steps involved in recombinant DNA technology?
+4. What is a restriction enzyme?
+5. What are the bacteria used in your protocol?
+6. Explain the calcium/phosphate (heat-shock) method and what it is used for.
+7. How can we selectively grow bacteria that have taken up the plasmid?
+8. Explain the principle behind blue and white screening and its purpose in this
+lab.
+
+References
+Kehoe A (1989). "The story of biosynthetic human insulin". In Sikdar SK, Bier M, Todd PW (eds.).
+Frontiers in Bioprocesssing. Boca Raton, FL: CRC Press. ISBN 978-0-8493-5839-5.
+https://www.sigmaaldrich.com/SE/en/technical-documents/technical-article/genomics/cloning-and
+expression/blue-white-screening
+https://www.nlm.nih.gov/exhibition/fromdnatobeer/exhibition-interactive/recombinant
+DNA/recombinant-dna-technology-alternative.html
+Khan, S., Ullah, M. W., Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Role of 
+Recombinant DNA Technology to Improve Life. International journal of genomics, 2016, 2405954. 
+https://doi.org/10.1155/2016/2405954
+https://www.thermofisher.com/se/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen
+school-of-molecular-biology/molecular-cloning/cloning/traditional-cloning-basics.html
+