diff --git a/content/Biokemi/Cellulära processer/Kontroll av genuttryck i prokaryoter/Slides.md b/content/Biokemi/Cellulära processer/Kontroll av genuttryck i prokaryoter/Slides.md new file mode 100644 index 0000000..f4c1a94 --- /dev/null +++ b/content/Biokemi/Cellulära processer/Kontroll av genuttryck i prokaryoter/Slides.md @@ -0,0 +1 @@ +Kontroll av genuttryck i prokaryoter Claes Gustafsson Ribonukleotidreduktas (RNR) Deoxiribonukleotider (dNTP) bildas från ribonukleotider (NTP). Detta sker genom att NTP reducerars, d.v.s. förlorar sin OH-grupp i 2’-position. Denna reaktion katalyseras av enyzmet ribonukleotidreduktas (RNR) – finns både hos prokaryoter och eukaryoter. VAD ÄR EN GEN? En nukleotidsekvens i DNA, som krävs för syntesen av ett fungerande protein eller en RNA-molekyl (inkl. tRNA, rRNA etc.) I genen ingår även de reglersekvenser som bestämmer när och hur mycket av genen som skall tillverkas. 3 Olika gener uttrycks olika mycket ”Housekeeping genes” är gener som alltid är påslagna och som behövs för att en cell skall fungera normalt. TranskriptionsinitieringKodande sträng och mall-sträng Båda strängarna i DNA kan används som mall-sträng för RNA syntes. Vilken sträng i DNA som skrivs av till RNA bestäms av den riktning som RNA-polymeraset rör sig RNA syntetiseras alltid i 5’ till 3’ riktning. Om man inte vet riktningen som RNA- polymeraset rör sig så kan man inte veta vilken sträng som är mall-sträng 8 Promotorn bestämmer i vilken riktning RNA- polymeraset skall transkribera! En transkriptionsenhet är den sekvens i DNA som transkriberas till RNA. Startar vid promotorn och slutar vid terminatorn. Hos bakterier kan en transkriptionsenhet bestå av flera gener Man brukar kalla en sådan enhet för ett ”operon” Det bildas ett långt mRNA som kodar för flera olika proteiner. Gener ger upphov till proteiner involverade i samma metabola ”pathway” återfinns i samma operon! I ett bakteriellt mRNA från ett operon finns många startplatser för translation! Vid AUG som skall användas för initiering finns speciella sekvenser i mRNA – s.k. Shine-Dalgarno sekvenser, som hjälper ribosomen att hitta rätt. Hur hittar bakteriellt RNA- polymeraset till promotorn? 12 E. coli RNA polymeras  (beta) är den katalytiska subenheten dvs. den som syntetiserar RNA i 5’ till 3’ riktning  (sigma) styr enzymet till promotorn (känner igen en särskild DNA-sekvens!) Sigma subenheten hjälper RNA-polymeraset att hitta till promotorn och påverkar enzymets allmänna egenskaper   ’   Kärnenzymet (saknar sigma) + Innehåller alla de subenheter av RNA- polymeras om behövs för syntes av RNA. Binder starkt till icke-specifikt DNA. Har mycket svårt att hitta promotorer.  14   ’    Holoenzymet (innehåller sigma) Kan hitta och specifikt binda till en promotor . Binder svagt till icke-specifikt DNA – kräver promotor- sekvens för att “fastna”. Hittar promotorn 10,000 gånger snabbare än kärnenzymet. Bakteriellt RNA-polymeras glider längs DNA och letar efter en promotor.  16 Efter initiering släpper sigma-faktorn och RNA- polymeraset fortsätter på egen hand. Det finns sju olika sigma-subenheter som reglerar olika typer av gener Gör det möjligt för bakterien att reglera uttryck av gener – kan välja att slå på eller av olika kombinationer av gener, beroende på situationen. Det finns särskilda sigma faktorer för snabb tillväxt, för att skydda mot värme- shock, för att stimulera rörelse etc. Aktivatorer och repressorer Nära promotorn finns bindningsplatser för proteiner som kan stimulera (aktivatorer) och stänga av (repressorer) transkription av alla dessa gener. 1819 I ett typiskt operon återfinns en ”operator”. Detta är en DNA-sekvens till vilken en repressor kan binda för att blockera initiering av transkription. Tryptofan-operonet - kodar för genprodukter som behövs för att bilda tryptofan Tryptofan-operonet kodar för genprodukter (enzymer) som behövs för att bilda aminosyran tryptofan Finns det lite tryptofan i omgivningen så behöver operonet uttryckas. Trp repressorn kan inte binda till operatorn och blockera transkription Finns det mycket tryptofan i omgivningen så behöver inte dessa enzymer uttryckas. Trp repressorn binder till operator-sekensen och blockerar transkription Inaktiv repressor Aktiv repressor När E coli har god tillgång på tryptofan i mediet, binder det till repressorn och orsakar en konformationsförändring så att repressorn kan binda till operatorn. Tryptofan fungerar som behövs för att repressorn skall vara aktiv! Tillgången på tryptofan reglerar tryptofanrepressorns aktivitet! Lac-operonet - kodar för genprodukter som behövs för att bryta ner laktos Glukos är förstahandsvalet som energikälla i bakterier. När det finns mycket glukos i cellerna är alternativa sockerkällor avstängda så att cellen huvudsakligen förbränner glukos. När det finns lite glukos i cellen kan arabinos, laktos eller andra sockermolekyler användas som energikällor. Förklarar varför Lac-operonet i normalfallet är avstängt! Vill endast slås på när glukos saknas! Och endast i de fall det finns laktos att tillgå! 26 Vid reglering av Lac-operonet samverkar en aktivator och en repressor CAP är en aktivator Två krav för transkription av Lac-operonet! 1. Ingen repressor bunden till operatorn! 2. Ett aktivatorprotein (CAP) som stimulerar initiering av transkription! Underlättar inbindning av RNA-polymeras. Kan öka transkriptionsnivån mer än 1000 gånger. Vissa aktivatorer behöver en mindre molekyl, en så kallad co-aktivator som binder till aktivatorn för att den skall vara aktiv. 28 Aktivatorer stimulerar transkription Co-activator I närvaro av laktos så bildas allolaktos. Binder till repressorn och får den att släppa operatorn. Observera skillnaden till trp- operonet! Lac-repressorn släpper operatorn när laktos finns närvarande i mediet. På det viset blockerar den inte längre transkription. (vid trp-operonet fick tryptofan repressorn att binda!). Hur regleras aktiviteten hos aktivatorn, d.v.s. proteinet CAP? I frånvaro av glukos så bildas molekylen cAMP. Binder till CAP, vilket får proteinet att fungera som en aktivator. Cykliskt adenosinmonofosfat “cAMP” – signalmolekyl med många funktioner! Aktivatorer och repressorer samverkar för att få reglerat genuttryck! Hur kan aktivatorn (CAP) samverka med repressorn för att få reglerat genuttryck från lac-operonet? I närvaro av glukos används inte lac-operonet. Även om laktos finns i omgivningen! Glukos är alltid bakteriens förstahandsval!! I frånvaro av glukos slås lac-operonet på! Men bara om det finns laktos i omgivningen! Antibiotika • För biologer är det ämnen som producerats av levande organismer i syfte att hålla andra organismer borta. • Inom medicinen kan dessa medel användas för att. behandla infektioner, men också vid cancersjukdom. Rifampicin binder till beta-subenheten i det bakteriella RNA polymeraset och blockerar elongering. Används t.ex. vid behandling av tuberkulos Principer för antibiotikas effekt – två exempel 1. Blockera initiering av transkription Principer för antibiotikas effekt – två exempel 2. Interkalation Actinomycin lägger sig mellan basparen i DNA. “interkalation” Stör t.ex. Transkription och DNA replikation Används vid cancerbehandling t.ex. ovarialcancer Det finns speciella virus som bara infekterar bakterier – Bakteriofager Bakteriofager infekterar bakterien och utnyttjar cellen för att skapa många nya kopior – bakterien dödas i en s.k. lytisk cykel Bakteriofag T7 RNA-polymeras används i ren form för att producera mRNA-vacciner mot t.ex. COVID. \ No newline at end of file diff --git a/content/Biokemi/Cellulära processer/Kromatin/Kromatin_VT2025-1.pdf b/content/Biokemi/Cellulära processer/Kromatin/Kromatin_VT2025-1.pdf deleted file mode 100644 index d4828b2..0000000 --- a/content/Biokemi/Cellulära processer/Kromatin/Kromatin_VT2025-1.pdf +++ /dev/null @@ -1,3 +0,0 @@ -version https://git-lfs.github.com/spec/v1 -oid sha256:b2d30507bdc62c110eb63357dbec4d3ac0590564a351dee1649f767f4bdb6841 -size 1342485 diff --git a/content/Biokemi/Cellulära processer/Kromatin/Slides.md b/content/Biokemi/Cellulära processer/Kromatin/Slides.md new file mode 100644 index 0000000..617b3f8 --- /dev/null +++ b/content/Biokemi/Cellulära processer/Kromatin/Slides.md @@ -0,0 +1,112 @@ + +# Kromosomer och kromatin + +## Grundprincip +- Nukleärt DNA är organiserat i kromosomer. +- I kärnan är DNA bundet till proteiner → **kromatin**. + +--- + +# Upptäckten av nukleosomen + +## Experimentet som avslöjade nukleosomen +1. Isolera kärnor +2. Klyv med ospecifikt endonukleas (DNase I) +3. Analysera fragmenten med gelelektrofores + +**Resultat:** +- Små ”pärlor” innehöll DNA (150–200 bp) + proteiner → **histoner**. + +--- + +# Histoner + +## Evolutionär konservering +- De små pärlorna visade sig innehålla en grupp **högt konserverade proteiner**. +- Exempel: histon H4 skiljer sig med endast **två aminosyror** mellan gröna ärtor och kor. +- Evolutionär distans: **≈1,3 miljarder år**. + +--- + +# Nukleosomen + +## Nucleosome core particle +En nukleosom består av: +- **2 × H2A** +- **2 × H2B** +- **2 × H3** +- **2 × H4** + +Totalt: **8 proteiner (histonoktamer)** +DNA: **146 bp** virat **1,75 varv** runt oktameren. + +--- + +## Histon H1 +- Ett femte histon som binder till **linker-DNA**. +- Mindre konserverat. +- Har en **stabiliserande effekt** på nukleosomen. + +--- + +# Kromatinets funktionella betydelse +- När DNA täcks av histoner → **repressiv effekt**. +- DNA måste öppnas för processer som: + - DNA-replikation + - Transkription + +--- + +# Histonsvansar + +## Struktur +- N-terminala delar (främst H3 och H4) sticker ut från nukleosomen. +- Dessa svansar påverkar hur hårt histoner binder DNA. + +## Modifieringar +- Modifieringar alters styrka i bindningen: + - **Acetylering** + - Neutraliserar positiva laddningar på lysin/arginin + - → svagare bindning till negativ DNA-ryggrad + - **Metylering** + - Flera andra modifieringar förekommer + +### Funktion +- Modifieringar kan **aktivera eller repressa** genuttryck. +- Detta är **epigenetisk reglering** → styrning utan förändring i DNA-sekvensen. + +--- + +# Histonkoden +- Den specifika **kombinationen** av modifieringar är avgörande. +- Kallas populärt **”histonkoden”**. + +--- + +# Histoner vid DNA-replikation +- Nukleosomer tas bort av replikationsmaskineriet och byggs om direkt bakom replikationsgaffeln. +- Gamla histoner fördelas **jämnt** mellan de två dottersträngarna. +- Detta ger **semikonservativ nedärvning** av epigenetiska markeringar. +- Specialiserade proteinmaskiner reglerar modifieringar (mer i termin 3). + +--- + +# Kromatinets organisation i högre nivåer + +## Organisation +- **A:** 30 nm-fiber i interfas-kromosom +- **B:** Nukleosomer längs DNA + +## Loopar och protein-ställningar +- DNA organiseras även i **loopar**, som fästs vid proteinstrukturer. +- Loopars aktivitet kan regleras via: + 1. **Histonmodifieringar** + 2. **Topoisomeraser** + +Dessa styr **åtkomlighet och packning** av det genetiska materialet. + +--- + +# Sammanfattning +- Flera nivåer av DNA-packning krävs för att få plats i cellkärnan. +- Reglering sker både via histonmodifieringar och strukturell organisering av kromatin. \ No newline at end of file diff --git a/content/Biokemi/Makromolekyler/Utforska proteiner/Instuderingsfrågor.md b/content/Biokemi/Makromolekyler/Utforska proteiner/Instuderingsfrågor.md deleted file mode 100644 index cd6f74d..0000000 --- a/content/Biokemi/Makromolekyler/Utforska proteiner/Instuderingsfrågor.md +++ /dev/null @@ -1,50 +0,0 @@ ---- -tags: - - biokemi - - utforska-proteiner - - instuderingsuppgifter ---- - -Vad är definitionen av ”genom”? -1. Vad menas med ”proteom”? -2. Vad menas med ett homogenisat? -3. Beskriv några egenskaper hos proteiner som kan användas för rening -4. I vilken storleksordning kommer proteinerna ut vid gelfiltrering? -5. Vilken laddning har de protein som binder en katjonbytare? -6. Vilken laddning har de protein som INTE binder till en katjonbytare? -7. Vilken laddning har de protein som binder en anjonbytare? -8. Vilken laddning har de protein som INTE binder till en anjonbytare? -9. Hur kan man eluera ut protein från en katjonbytare? -10. Vad menas med affinitetskromatografi? -11. Hur kan man eluera ett protein med 6xHistag från en Nickel(II)-kolonn? -12. Vad kallas det automatiserade system som kan användas för proteinrening? -13. Vilken parameter brukar man följa? -14. Vilken typ av medium (gel) används för en SDS-PAGE? -15. Vad är SDS? -16. Vilken laddning har SDS? -17. Vilka molekyler hamnar längst upp respektive längst ner på en SDS-PAGE gel? -18. Hur kan man visualisera en SDS-PAGE efter körning? -19. Varför menas med proteinreferens för SDS-PAGE? -20. Vad är isoelektrisk fokusering? -21. Vad är två-dimensionell gelelektrofores? -22. Hur kan en SDS-PAGE användas för att följa proteinrening? -23. Vad är en antikropp? -24. Vad är ett antigen? -25. Vad är en epitop? -26. Vad kännetecknar en monoklonal antikropp? -27. Vad kännetecknar polyklonala antikroppar? -28. Hur tillverkas monoklonala antikroppar? -29. Beskriv ELISA -30. Beskriv Indirekt ELISA -31. Beskriv Sandwich ELISA -32. Vilken av de två ELISA-metoderna är mer specifik? -33. Nämn kliniska applikationer för de båda ELISA-metoderna. -34. Vad är Western blot? -35. Vad är skillnaden på SDS-PAGE och Western blot? -36. Vilka substanser kan masspektrometri detektera? -37. Nämn några användningsområden för masspektrometri. -38. Varför behöver vi kristaller för röntgenkristallografi? -39. Varför är det viktigt med hög upplösning? -40. Nämn den vanligaste atomen som används för Nuclear Magnetic Resonance (NMR). -41. Vad är den främsta fördelen med att använda kryo-elektronmikroskopi istället för -röntgenkristallografi? \ No newline at end of file diff --git a/content/Biokemi/Makromolekyler/Utforska proteiner/Lärandemål.md b/content/Biokemi/Makromolekyler/Utforska proteiner/Lärandemål.md deleted file mode 100644 index fd97ff2..0000000 --- a/content/Biokemi/Makromolekyler/Utforska proteiner/Lärandemål.md +++ /dev/null @@ -1,21 +0,0 @@ ---- -tags: - - biokemi - - utforska-proteiner - - lärandemål ---- - -#### Nyckelord - -Innebörden av begreppet proteom. -Skillnader i proteiners kemiska och fysikaliska egenskaper samt hur dessa ligger till grund för olika principer för renframställning av proteiner. -Gelfiltrering, jonbyteskromatografi, affinitetskromatografi. -Principer och tillämpning av elektrofores (SDS-PAGE, isoelektrisk fokusering). -Översiktlig beskrivning av protein-analys med immunologiska tekniker och 'blottning'. Antikropp och antigen. -Skillnaden mellan monoklonala och polyklonala antikroppar m a p igenkänning av antigen. -Principen för detektion av antikroppar med ELISA-metoden. -Exempel på kliniska tillämpningar för ELISA. -Förutsättningarna för proteinstrukturbestämning med röntgenkristallografi, NMR och cryo-EM och deras applikation på medicinskt relevanta proteiner. - -#### Mål -Beskriva metoder för undersökning av proteiners struktur och funktion \ No newline at end of file diff --git a/content/Biokemi/Makromolekyler/Utforska proteiner/Provfrågor.md b/content/Biokemi/Makromolekyler/Utforska proteiner/Provfrågor.md deleted file mode 100644 index f0463ee..0000000 --- a/content/Biokemi/Makromolekyler/Utforska proteiner/Provfrågor.md +++ /dev/null @@ -1,66 +0,0 @@ ---- -tags: - - biokemi - - provfrågor - - utforska-proteiner ---- - -**8** Du har fått i uppgift att analysera proteiner i en lösning med hjälp av SDS-PAGE. (Max 150 ord) -A) Förklara principen för metoden. -B) Vad fyller SDS för funktion? -C) Vilken egenskap hos proteinet används för separation? - -Du träffar en patient som du misstänker har drabbats av HIV. Du kommer att använda en Indirekt -ELISA för att ta reda på detta. (Max 150 ord.) (2p) -A) Beskriv de olika stegen för en Indirekt ELISA. -B) Detekterar denna metod patientens antikropp eller antigen? - -Du har fått i uppgift att preparera fram ett protein ur ett homogenisat och du kommer använda tre olika metoder för detta. Beskriv varje metod kortfattat samt ange vilken proteinegenskap som används för separationen (2p) (Max 200 ord) - -A. Gelfiltrering -B. Jonbyteskromatografi -C. Affinitetskromatografi - -Du jobbar på labb över sommaren och har fått i uppgift att köra affinitetskromatografi med en 6xHis tag. - -A) Beskriv kortfattat principen för affinitetskromatografi. -B) Hur kan man eluera proteinet? -C) Ange en metod som kan användas för analys av det eluerade proteinet. - -Du har fått i uppgift att göra en proteinrening med hjälp av gelfiltrering samt att analysera resultatet av denna (2p). _Max 200 ord_. -A) Beskriv metoden för gelfiltrering. -B) Vilken egenskap hos proteinet bygger metoden på? - ----- -Du jobbar på labb över sommaren och har fått i uppgift att göra en rening av ett protein baserat på laddning (4p). (Max 200 ord) - -a) Beskriv vilken metod du skulle använda dig av och hur denna fungerar. -b) Ange en metod för att analysera storleken på ditt framrenade protein och ge en förklaring till hur denna fungerar. - ----- -Du jobbar på labb över sommaren och har fått in en patient som du misstänker är smittad av -COVID-19 (4p). (Max 200 ord.) -a) Beskriv en analysmetod för att undersöka detta. -b) Vilken substans hos patienten undersöks med denna metod? - ----- -Du jobbar på ett labb över sommaren och har fått i uppgift att göra en rening av ett protein med hjälp av affinitetskromatografi. - -A) Beskriv egenskaper hos proteinet och kolonnen som möjliggör rening med hjälp av affinitetskromatografi. -B) Ange en metod för att analysera storleken på ditt framrenade protein och ge en kortfattad förklaring till hur denna fungerar. - ----- -Du jobbar på labb över sommaren och du har fått i uppgift att utföra en ELISA för att undersöka om en patient har HIV. Beskriv vilken typ av ELISA som skall utföras, vilka steg som utförs och ange vilken substans hos patienten som undersöks med metoden. - ----- -Du jobbar på labb över sommaren och har fått i uppgift att göra en rening av ett protein med hjälp av gelfiltrering. Proteinet innehåller också en his-tagg. - ----- - -A) Beskriv egenskaper hos proteinet och kolonnen som möjliggör rening med hjälp av gelfiltrering. -B) Proteinet innehåller också en his-tagg. Beskriv vad en his-tag är och hur den kan användas för rening och detektion. - ----- -Du jobbar på labb över sommaren och har fått in en patient som du misstänker är smittad av HIV. -A) Nämn en analysmetod som kan användas för att undersöka detta samt beskriv de olika stegen i metoden. -B) Vilken substans hos patienten undersöks med denna metod? \ No newline at end of file diff --git a/content/Biokemi/Makromolekyler/Utforska proteiner/Utforska proteiner Anteckningar.md b/content/Biokemi/Makromolekyler/Utforska proteiner/Utforska proteiner Anteckningar.md deleted file mode 100644 index e02f81a..0000000 --- a/content/Biokemi/Makromolekyler/Utforska proteiner/Utforska proteiner Anteckningar.md +++ /dev/null @@ -1,266 +0,0 @@ ---- -tags: - - biokemi - - utforska-proteiner - - anteckningar -föreläsare: Linda Johansson ---- - -Vad som helst som kommer på presentationen kan komma. -Ibland vävs avsnitt tillsammans med seminarier osv. -Instuderingsfrågorna kommer hjälpa till, konceptuella - -Varför studera proteiner? -- Hur ser strukturen ut? -- Vad binder de till? -- Var finns det? -- Sjukdomspåverkan - -Klinkien: -+ antikroppar och antigen -+ ELISA-metoden -+ COVID antigen och antikroppar som är intressanta -+ misstänkt myelom - -Proteom -- **Genom** vårt totala DNA innehåll - 3 miljarder DNA baser, 23000 gener -- **Protem** - - alla faktiska proteiner som uttrycks av en given cell, vid en given tidpunkt - - inkluderar modifikationer - - inkluderar interaktioner - - kan skilja sig mycket mellan en given cell och en given tidpunkt - - många kombinationer - - iniaitiv, alphacell - -Studera proteiner -- först måste man rena fram ett specifikt protein -- kan separeras (avgörs av aminosyrasekvensen) - - efter storlek - - efter laddning - - efter löslighet - - efter bindningsaffinitet - -#### Preparation av protein -1. krossar det och gör det till flytande massa (fiska ut sitt protein ur sin cell) - - kallas även homogenisat (mixern) - - blir en slags gegga/smoothie, vilket gör att de lösgörs -2. separerar proteinerna - - via ett centrifugeringssteg - - tunga sakerna hamnar längst ner och lättare högre upp - - i botten av röret heter det: **pellet** och det ovan kallas **supernatat** - - egentligen blir det en gradient från minst till störst - - storleksskillnaden är enorm - -#### Kromatografi -Finns olika typer, men först gemensamt: -- köper en form av små beads/kulor, som har olika egenskaper - - man köper beads för den motsvarigheten av kromotografi som man vill utföra - - välja det som passar bäst. kallas för **fast fas** -- förpackas i en kolonn - - ett långt rör av kulor - - prov in (applicerar sitt prov) - - prov ut som är renat på något sätt -- kräver en fast fas (pekar på mitten av röret) - - själva kulor -- mobil fas - - provet ingår i detta - - en buffert - -eulueras = det är då provet kommer ut, betyder olika saker beroende på - -#### Gelfiltrering -Separation med avseende på storlek -Kolonn med porösa kulor (garnnystan) -Stora prover kommer ut före små -Grov och fin separation möjlig - kan behöva utföra det i flera steg -![[Pasted image 20251117134344.png|400]] -Bromsas in beroende på storlek: -- gul → grön → rosa i hastighet -![[Pasted image 20251117134540.png|300]] - -#### Jonbyteskromatografi -Separation med avseende på laddning -Aminosyrasekvensen avgör den totala laddningen hos proteinet - -Två typer av kolonner innehåller -- Anjonbytare, binder negativt laddade grupper (positivt laddade går igenom) -- Katjonbrytare binder positit laddade grupper (negativt laddade går igenom) - -*Om man tillsätter salt på ett kontrollerat sätt, kan man samla upp varenda liten del, då går det lätt att isolera. Saltet gör att man får större kontroll av renhet genom att lägga till en viss koncentration av salt. Ibland kan det finnas 3000 andra proteiner med andra laddningar, som åker rakt igenom. De flesta åker rakt igenom men några få kan sitta kvar, där av kan man använda salt.* - -Kan kontrollera när det kommer ut (t.ex. via salt) lite mer reningsjobb - -Elueras baserat på pH eller salt (ofta båda) -![[Pasted image 20251117134953.png|300]] - -katjon = katt = positiv! - -#### Affinitetskromatografi -Separation med avseende på selektivtet -Specifik egenskap (t.ex. gluksmodifikation), för att binda till en kolonn med glukosbindande egenskapr. -Exempel: -- På DNA-nivå adderas en sträng av 6st Histidinaminosyror (6xHis tag). -- Dessa binder mycket starkt till en kolonn innehållande nickel (II) joner. -- Proteinet elueras ut med t.ex. imidazol -![[Pasted image 20251117135916.png|300]] - -Kanska likt jonbindande, på varje bead sitter något som ditt prov binder till. Precis som jonbyteskromatografi så släpper man ut det som inte är intressant. -Två steg: -1. först sitter proteinet på bindningarn -2. sen sätter man till glukos som konkurrerar ut ditt protein så de släpper - -## Analys av proteiner - -Ofta behöver man göra olika reningssteg. -Vi är människor och gör ofta fel, så man behöver verifiera att rätt protein har renats fram. -1. vilken renhet som önskas -2. vilka egenskapr sin finns - -#### Gelelektrofores -Liknas Plasmid men för protein istället för DNA - -En molekyl har en viss nettoladdning och kommer röra sig i ett elektroniskt fält, detta kallas ektrofores. -Metoden kallas PAGE ((polyacrylamide gel electrophoresis) - -- Polyakrylamiden bildar ett nät där stora bromsar och små slinker igenom -- Alla vandrar mot + polen -- Liknar gelfiltrering men tvärtom - - -### Gelelektrofores: SDS Page -![[Pasted image 20251117142658.png|300]] -vanligaste typen av gelelektrofores heter SDS Page - -Lägger till SDS (sodium dodecyl sulfate) -ett stort protein kommer binda fler och ett litet protein färre. -- ett proteins laddning är proportionellt mot dess massa (kDa) -- binder till yta, störra yta större SDS, mindre yta mindre SDS - -Man blandar proteiner med en känd storlek, som en refens. Det laddas i så-kallade -brunnar. -När man är klar med körningen, laddar men in en proteinbindande färg. - -Varje kolumn är ett reningstillfällende, sen lägger man till mer i steg, så då har - -- I första steget har man många sträck, varje streck är ett protein -- I tredje steget, jonbryteskromatografi, här är det väldigt många extra streck, det betyder att proteinet inte är rent. -- I fjärde steget gelfiltreringen blir det få kvar -- I femte blir det affinitetskromotagrfri och efter det finns det bara ett kvar - - - -**Gelfiltrering vs. gelelektrofores** - -| Gelfiltrering | Gelelektrofores | -| -------------------------------------------------- | -------------------------------------------------- | -| Separation av proteiner med
avseende på storlek | Separation av proteiner med
avseende på storlek | -| Används för protein**rening** | Används för protein**analys** | -| Störst först | Minst först | - -### Antikroppar och antigen -Antikroppar är proteiner som genereras i respons mot främmande element (antigen). -Bindning av antikropp till antigen leder till immunrespons som skydar individen mot infektion -De grupper eller aminorysor som antikroppen knner igen kallas **EPITOP** - -#### Polyklonala antikroppar -Det är en mix av antikroppar, känner igen olika *epitoper* -#### Monoklonala antikroppar -Känner igen exakt samma *epitop* av en specifik antigen - -antigen = min hand -monoklonal = min hands tumme -polyklonal = alla fingrar på min hand - -#### ELISA - -Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay kan användas för att kvantifiera protein (eller antigen) i ett prov -En antikropp länkas kovalent till ett enzym-antikropp kan ge färg till ett visst substrat -Om ett prov har ett antigen kommer enzym-antikropp binda till antigenet - -### Indirekt ELISA -detekterar antikroppar - -![[Pasted image 20251117143608.png|400]] - - -1. Antigen fästs i en brunn -2. Om patienten har antikroppar för viruset kommer de binda till antigenet -3. Om enzymbundet antikropp känner igen den specifika anikroppen -4. Substrat adderas → om färg → betyder att personen bär på HIV antikroppar - -### Sandwich ELISA -detekterar antigen - -- Används för att detektera antigen, t.ex. för COVID-19 -- Antikroppar sätts i en brunn -- Tillsätt prov -- En enzymbärande antikropp (som också binder antigenet) appliceras -- Substrat adderas → om färg → antigen finns i provet -![[Pasted image 20251117143805.png|400]] - - -### Western blot -Första steget är att köra en SDS-PAGE -- Intresserad av många band -- lösningen är att köra en WB genom att göra över proteiner itll ett membran -- Inkubera med primär antikropp -- Inkubera med sekundär antikropp (som bär ett enzym eller fluorescens) → mät färgskifte -Det binder bara mot ett specifikt protein - - -### Masspektrometri -Används för att identifiera peptider och proteiner -Kan detektera posttranslationella modifikationer -- t.ex ett socker eller någon irreversibel modifikation -Man slår sönder sitt protein i mindre delar, så man får peptider -Dessa joniseras och körs i en masspektrometer som heter MALDI-TOF - -Den är ganska komplicerad, men tänk mer på användningsområden. -- Kan användas för att sekvenser **ett okänt protein** -- Kan användas för att. verifiera att **rätt protein** renats fram -- posttranslationella modifikationer kan identifieras -- Går att skicka till ett labb här i gbg och få information om - - evolutionärt ursprung - - identifier medlemmar i ett stort proteinkomplex - - identifiera signalkomplex (t.ex 50 olika medlemmar) - - sönderdela och kör det mot en databas, vi har hela människans genom och den kan vi översätta till proteinsekvensen. Men vi vet inte proteom, specifika för en viss cell. - - - -#### Strukturbestämming av protein -Vad föreläsaren jobbar med. -Vill veta hur olika proteiner ser ut. Trots AI svårt att förutsåp den exakta strukturen. Men det brukar finnas några överraskningar. -Vi vill fortfarande bestämma strukturen experimentellt -Viktigt för läkemedelsutveckling -Läkemedelsbolag vill veta hur liganderna interagerar med ett protein. -Kan komma på nya proteiner som kan binda till ditt protein - -#### NMR -Baserat på är att atomkärnor är nära varandra och magnetiska -Det finns inte så många isotoper har den magnetismen. -Men väte har det! -Man tillför en elektromagnetisk puls, då kan man få en resonans. Då kan man undersöka protonens omgivning. Men kan undersöka en proteins omgivning per gång → en dimensionell NMR -NOESY: undersöker protonpar som är nära varandra. Det kan man använda för att få information om proteinens 3D-struktur. -Det finns många limiteringar i den här typen av experiment. -Nackdelen är att man bara kan titta på små proteiner < 50 kDa - - -### Röntgenkkristallografi -Kristalliserar proteinet som är tidskrävande ofta - -Exponerar mot röntgenstrålning och det mönstret som man får. -Sen med hjälp av dator kan man ta reda på vad det är för protein. -Ju högre upplösning ju högre detalj. - -Ersatts av - -#### Kryo-Elektronmikroskopi -Mikroskopbaserad metod, behöver inte kristallisera sina proteiner istället. -Inga specifika egenskapr hos proteinet behövs )inga kristaller, inga specifika isotoper - -Mycket snabb utvecling de senaste 5-10 åren. - -Använder sig av framrenat protein, man fryser det med flytande helium och sen så sätter man det under sitt mikroskop. Varje enskild proteinartikel kommer man sätta samman i en 3d-struktur. - -![[Pasted image 20251117145754.png]] -en sån här molekyl som hjälper er att känns skillnaden i temperatur. \ No newline at end of file